五倍子抑菌物質(zhì)的提取及其抑菌作用的研究

張 霞，孫寶忠，哈斯格根，艾啟俊，*，李 洋，康 麗，楊艾青（.北京農(nóng)學院食品科學系，北京006；

2.中國農(nóng)業(yè)科學院，北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

五倍子抑菌物質(zhì)的提取及其抑菌作用的研究

張 霞1，孫寶忠2，哈斯格根3，艾啟俊1，*，李 洋1，康 麗1，楊艾青1（1.北京農(nóng)學院食品科學系，北京102206；

2.中國農(nóng)業(yè)科學院，北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

采用L16（44）正交設計實驗，對五倍子抑菌物質(zhì)的提取工藝進行研究。從五倍子提取液的光譜特性入手，選定料液比、浸提時間、浸提溫度、浸提功率四個工藝因素，先進行單因素實驗，然后進行四因素四水平正交實驗，確定最佳工藝條件為：料液比1∶10，提取時間60min，提取溫度70℃，提取功率35kHz。50mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相當于2.5mg/mL的青霉素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。從生長曲線的繪制看來，高濃度的提取液都在菌體對數(shù)生長期進行抑制，達到抑菌效果。

五倍子，抑菌物質(zhì)，提取工藝，抑菌作用

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五倍子 購于北京市回龍觀大藥房；大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由北京農(nóng)學院食品系微生物實驗室提供；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基［6］。

YX-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設備廠；SW-CJ-1FD無菌操作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司提供；Blue pard GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；7520型紫外可見分光光度計 上海第三分析儀器廠；氫氧化鈉，鹽酸，pH試紙，6mm直徑的牛津杯，游標卡尺等。

1.2 實驗方法

1.2.1 光譜特征研究 由于五倍子提取物的抑菌成分是多種成分組合在一起，必須對其進行光譜特征研究。取五倍子水提液適量，稀釋定容，用7520可見分光光度計掃描，確定最高吸收峰，為正交實驗確定最佳提取工藝條件做準備［7］。

1.2.2 五倍子抑菌物質(zhì)提取工藝研究

1.2.2.1 單因素對提取效果的影響 根據(jù)應用對象為食品，從安全出發(fā)，研究料液比（A）、浸提時間（B）、浸提溫度（C）、超聲波頻率（D）等因素對提取效果的影響，篩選最佳提取工藝。

1.2.2.2 復合因素對提取效果的影響 選用L16（44）正交表進行正交實驗，因素水平見表1。

表1 實驗因素水平表

將五倍子藥材研磨成粉末狀，準確稱取2.0g五倍子粉末，放入具塞三角瓶中，按單因素和L16（44）正交表進行提取，過濾得濾液，濾渣重新提取一次，將兩次濾液合并，取適量稀釋定容，在7520可見分光光度計上最大吸收波長處測OD值。

1.2.3 五倍子浸提液抑菌效果的研究

1.2.3.1 五倍子最小抑菌濃度（MIC）的測定［8］用LB液體培養(yǎng)基將五倍子提取物稀釋成含生藥100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56g/mL的藥基，對照為LB液體培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的測試菌中分別加入到藥基中，使每毫升藥基含菌體105個，將各試管放入搖床中培養(yǎng)（37℃，130r/min）。24h后取出培養(yǎng)物劃線于LB瓊脂培養(yǎng)基上，平皿置于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后取出觀察，平皿上的菌落數(shù)小于5個的最小稀釋度的藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.3.2 五倍子浸提液對測試菌生長曲線的影響［9］

取五倍子浸提液，稀釋，依次配制成濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56g/mL的溶液，放入試管中，依次標號為1、2、3、4、5、6、7。另取兩只試管，一支加入空白液體培養(yǎng)基，作為陰性對照，標號為8；另一只加入青霉素作為陽性對照，標號為9。在九支試管中加入等量的金黃色葡萄球菌，混合均勻。

取九支試管，分別加入濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56g/mL的五倍子浸提液，青霉素和液體培養(yǎng)基，加入等量的大腸桿菌，混合均勻。

將上述配制好的18支試管都放入恒溫振蕩器中，培養(yǎng)24h，取出后在分光光度計上測定其OD值。培養(yǎng)液OD值與培養(yǎng)液內(nèi)細菌繁殖速度呈正相關，OD值升高越快，表示培養(yǎng)液內(nèi)細菌濃度越高。培養(yǎng)液由于加入了五倍子浸提物中的抑菌成分，起到抑菌作用，故可抑制培養(yǎng)液OD值上升。

1.2.3.3 不同濃度五倍子浸提液與青霉素抑菌效果的研究 取7只試管，除第一支以外均加入10mL生理鹽水，在第一支試管中加入20mL五倍子浸提液，取10mL加入第二支試管中，振蕩使第二支試管中的液體混合均勻。從第二支試管中取出10mL加入到第三支試管中，依次類推，直到稀釋到第七支試管，將第七支試管混合均勻后從中吸取10mL液體倒掉。至此已將五倍子浸提液濃度稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56mg/mL。

再取6支試管，除了第一支外均加入10mL生理鹽水，第一支試管中加入青霉素溶液20mL，從中吸取10mL加入到第二支試管中，將第二支混合均勻后吸取10mL加入到第三支試管中，以此類推，到第六支試管，將第六支試管混合均勻后吸取10mL倒掉。至此已將青霉素的濃度稀釋至40、20、10、5、2.5、1.25mg/mL六個梯度。

取26個滅菌培養(yǎng)皿，倒入適量融化并冷卻的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在13個皿中注入一定量的大腸桿菌，在另13個培養(yǎng)皿中注入等量的金黃色葡萄球菌，在酒精燈下涂布，使細菌分布均勻。每個培養(yǎng)基中等距離放入三個已滅菌的牛津杯，將上述配制好的不同濃度的五倍子浸提液和青霉素溶液注入到牛津杯中，上述操作應該在滅菌的條件下進行。

完成上述過程后，將26個培養(yǎng)皿放到培養(yǎng)箱中，在37℃條件下，培養(yǎng)24h，取出后用十字交叉法測量其牛津杯周圍抑菌圈直徑大小。

2 結果與分析

2.1 五倍子提取物的光譜特性

在可見分光光度計下的光譜特性結果見圖1。

圖1 五倍子水提液最大吸收波長的初步測定

由圖1可見，五倍子提取液在350～360nm之間出現(xiàn)了最大的吸收峰，可以初步確定五倍子的最大吸收波長在350～360nm之間。繼續(xù)做精確測定，結果見圖2。

從圖2可以清晰地看出，五倍子浸提液的最高吸收峰為358nm，其吸光度值為0.578。測出的吸收峰與《現(xiàn)代中草藥成分化學》［10］中介紹的五倍子最高吸收峰（360±2nm）有差距，但差距不大。因此確定358nm為本實驗中五倍子提取液的最大吸收波長，為后續(xù)工藝實驗做準備。

2.2 五倍子抑菌物提取工藝的確定

2.2.1 單因素實驗結果

圖2 五倍子水提取液最大吸收波長精確測定

2.2.1.1 料液比 在浸提溫度為70℃，浸提時間為30min，超聲波頻率為25kHz下進行浸提，結果見圖3。

圖3 不同料液比的提取結果

由圖3可知，隨料液比逐漸減少，提取效果先增加后減小，在1∶15的料液比時，提取效果最好。

2.2.1.2 浸提時間 在浸提溫度70℃，超聲波頻率為25kHz，料液比1∶25下進行浸提，結果見圖4。

圖4 不同浸提時間的提取結果

從圖4可以看出，隨時間增加，提取效果逐漸增加，但并不是浸提時間越長越好，當提取時間超過50min后，增加趨勢減弱，故以50min效果較佳。

2.2.1.3 浸提溫度 在料液比1∶25，浸提時間60min，超聲波頻率為25kHz條件下進行浸提，結果見圖5。

圖5 不同浸提溫度的提取結果

由圖5可知，隨溫度升高，提取效果逐漸增加，但當溫度大于70℃后，提取效果降低，故選70℃為最佳提取溫度。

2.2.1.4 超聲波頻率 在浸提溫度為70℃，浸提時間30min，料液比1∶15下進行浸提，結果見圖6。

圖6 不同提取功率的提取結果

從圖6可以看出，超聲頻率在30kHz內(nèi)，OD值隨時間的延長而增大，以30kHz為最佳；超過30kHz后，OD值呈下降趨勢。

2.2.2 正交實驗結果 按L16（44）正交表進行正交實驗，結果見表2。

表2 L16（44）的正交實驗結果與分析

采用SAS13.0 windows數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)處理，方差分析見表3。

表3 方差分析表

從表2、表3的實驗結果可知，采用超聲波輔助水浴加熱，各因素對提取五倍子中抑菌成分都存在著顯著影響，其影響程度排列順序為A＞C＞D＞B。綜合分析最佳組合為A1B4C3D3，即料液比為1∶10，提取時間為 60min，提取溫度為 70℃，提取功率為35kHz，但由于在正交實驗中沒有此組合，所以進行驗證實驗，結果得其吸光值為0.792。

2.3 五倍子提取液對測試菌生長曲線抑制的研究結果

由圖7可以看出，隨提取液濃度的降低，抑菌效果也隨之降低。且大腸桿菌在培養(yǎng)前11h內(nèi)呈明顯上升趨勢，加有100～25mg/mL提取液的試管內(nèi)的菌體濃度還出現(xiàn)了增長峰。說明提取液在12.5mg/mL濃度以上對大腸桿菌對數(shù)期的增長有明顯抑制作用。但與CK-（青霉素溶液）的抑菌效果還有一定差距。

圖7 五倍子對大腸桿菌生長曲線的影響

由圖8可以看出，金黃色葡萄球菌的濃度在培養(yǎng)前10h呈明顯上升趨勢，但隨后趨于穩(wěn)定，在14h其OD值達到最大值，以后維持穩(wěn)定狀態(tài)。五倍子提取液濃度越高，抑菌效果越明顯，浸提液濃度為100mg/mL時抑菌效果最好。隨著五倍子浸提液濃度的下降，試管中金黃色葡萄球菌的OD值逐漸增加，說明金黃色葡萄球菌的濃度在逐漸增加，五倍子浸提液對金黃色葡萄球菌的抑制作用在逐漸減小。同時與青霉素對金黃色葡萄球菌的抑制作用相比，青霉素溶液的抑菌效果是很明顯的，金黃色葡萄球菌的濃度一直很低。只加液體培養(yǎng)基的試管其金黃色葡萄球菌在前15h之內(nèi)，快速生長繁殖，其OD值達到了0.910。

圖8 五倍子對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

2.4 五倍子提取液的抑菌效果

2.4.1 平板法測定抑菌效果 結果表明，五倍子提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有明顯的抑菌作用（見表4）。

表4 五倍子提取液的最小抑菌濃度（MIC）

從表4可知，五倍子浸提液對大腸桿菌最低抑菌濃度為12.5mg/mL，而對金黃色葡萄球菌的效果更好，最低抑菌濃度為6.25mg/mL。

2.4.2 不同濃度的五倍子浸提物與青霉素抑菌效果的比較 從表5可以得出，隨著五倍子提取液濃度的下降，抑菌作用也隨之下降。從表6可以看出，隨著青霉素濃度的下降，抑菌作用也隨之下降。兩表相比較可以看出，50mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相當于2.5mg/mL的青霉素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

表5 不同濃度五倍子浸提物的抑菌效果

表6 不同濃度青霉素的抑菌效果

3 結論與討論

3.1 五倍子天然抗菌物質(zhì)的提取采用超聲輔助水提取法，4個因素對五倍子抑菌活性物質(zhì)提取效果的影響大小順序為：料液比＞提取溫度＞超聲波提取頻率＞提取時間。最佳提取工藝條件為：料液比為1∶10，提取時間為60min，提取溫度為70℃，提取功率為35kHz。

3.2 五倍子提取液中的抑菌成分對供試的兩種細菌均具有明顯的抑菌作用，最小抑菌濃度分別為：對大腸桿菌12.5mg/mL；對金黃色葡萄球菌6.25mg/mL。

3.3 通過抑菌效果對比實驗，證明50mg/mL的五倍子浸提物的抑菌效果相當于2.5mg/mL的青霉素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

3.4 五倍子提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。從繪制的生長曲線看來，高濃度的提取液都在菌體對數(shù)生長期進行抑制，達到抑菌效果。

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Study on ultrasonic-assisted extraction technology and antimicrobial activity of gallnut water extract

ZHANG Xia1，SUN Bao-zhong2，HASI Gegen3，AI Qi-jun1，*，LI Yang1，KANG Li1，YANG Ai-qing1
（1.Department of Food Science，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Institute of Zootechnics and Veterinary Science，China Academy of Agricultural Science，Beijing 100193，China；3.Food Science and Engineering Department，Inner Mongolia Agriculture University，Hohhot 010018，China）

The L16（44）orthogonal design experiments were used to research gaIInut antibacterial substances on extraction process.Extracts from the gaIInut start the spectral properties of selected materials ratio，extraction time，extraction temperature，extraction power of the four process factors.To determine the optimum process conditions，single-factor test first and then proceed to four-level orthogonal experimental factors.The optimum conditions for the extracts were materials ratio to 1∶10，extraction time 60min，extraction temperature 70℃，extraction power 35kHz.The antibiotic effect of 50mg/mL of gallnut extract equivalent to 2.5mg/mL of the antibiotic effect of penicillin on Escherichia coIi and StaphyIococcus aureus.From the growth curve，the high concentrations of extract inhibit bacteria in the logarithmic phase.

gaIInut；antibacterial substances；extraction process；antibiotic

TS201.2

B

1002-0306（2010）07-0290-05

五倍子（Galla Chinensis），又稱文蛤、百蟲倉、木附子，是由五倍子蚜蟲Melaphis chinensis（Bell）Baker寄生在漆樹科植物鹽膚木（Rhus chinensis Mill.）、青麩楊（Rhus potaninii Maxim）或紅麩楊（Rhus punjabensis Stew.var.sinica（Diels）Rehd.et Wils.）葉上形成的蟲癭［1］。五倍子的主要化學成分［2］是鞣質(zhì)類，如五倍子鞣質(zhì)、縮合沒食子鞣質(zhì)等；還含有脂肪、樹脂、蠟質(zhì)、烏氨酸等，這些化學成分具有較強的抑菌作用。據(jù)報道：五倍子對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、鏈球菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、白喉桿菌、炭疽桿菌、綠膿桿菌等均有明顯的抑菌或殺菌作用［3-5］。本實驗從五倍子提取液的光譜特性入手，借助于超聲波提取技術，選定料液比、浸提時間、浸提溫度、浸提功率四個工藝因素，先進行單因素實驗，然后進行四因素四水平正交實驗，確定最佳工藝條件，通過與青霉素對照，研究五倍子提取液的抑菌作用。

2009-07-07 *通訊聯(lián)系人

張霞（1985-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品安全與控制。

國家科技支撐計劃項目（2006BAD05A17）。