新疆馬鈴薯瘡痂病病原的鑒定

杜娟,任娟,趙思峰,任毓忠

(石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

新疆馬鈴薯瘡痂病病原的鑒定

杜娟,任娟,趙思峰,任毓忠

(石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

為了確定2008年首次發(fā)生在新疆的馬鈴薯瘡痂病的病原,以小薯片法和蘿卜幼苗法測(cè)定分離物的致病性,對(duì)來(lái)自新疆伊犁地區(qū)表現(xiàn)明顯瘡痂癥狀的薯塊進(jìn)行了病原的分離。經(jīng)對(duì)分離物形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化反應(yīng)的測(cè)定以及16S rDNA序列的分析比對(duì)。結(jié)果表明,引起新疆馬鈴薯瘡痂病的病原為 Streptomyces acidiscabies和S.scabies;其中 S.acidiscabies是引起新疆馬鈴薯瘡痂病的優(yōu)勢(shì)種,且其致病力明顯強(qiáng)于S.scabies。

馬鈴薯瘡痂病;16S rDNA序列;鏈霉菌;鑒定

Abstract:All isolates were obtained from scab potato tubers collected from Yili,Xinjiang.These isolates have pathogenicity to chips of potato and seedlings of radish.Pathogenic isolates were identified asStreptomyces acidiscabiesandS.scabiesbased on morphological,physiological,biochemical characterizations and 16S ribosomal DNA sequence analysis.Pathogenicity that ofS.acidiscabiesis higher than that ofS.scabies.The disease was first reported in Xinjiang.

Key words:potato scab;Streptomyces;16S rDNA sequence;identification

馬鈴薯是世界上僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物,也是世界上最重要的非禾本科作物。馬鈴薯瘡痂病(potato scab)在世界各地馬鈴薯種植區(qū)普遍發(fā)生[1],感染該病的薯塊的表面形成痂狀病斑,可造成薯塊質(zhì)量下降和商品質(zhì)量的降低。由于該病發(fā)生初期對(duì)產(chǎn)量的影響不大,往往被人們忽視,從而致使該病有逐年加重的趨勢(shì)。

引起馬鈴薯瘡痂病的種類很多,目前國(guó)外報(bào)道引起馬鈴薯瘡痂病的病原菌主要有 Streptomyces scabies、S.acidiscabies、S.aureof aciens,S.europaeiscabiei、S.luridiscabiei、S.niveiscabiei、S.puniciscabiei、S.reticuliscabiei、S.Stelliscabiei 和 S.turgidiscabies等[1-4],并且還不斷有新的瘡痂致病種被報(bào)道[5-6]。趙偉全等[7]對(duì)我國(guó)10個(gè)省區(qū)的馬鈴薯瘡痂病菌進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明病原菌為 Streptomyces scabies、S.acidiscabies及1個(gè)未知種。張萌等[8]對(duì)國(guó)內(nèi)8個(gè)省區(qū)的馬鈴薯瘡痂病菌采用16S rDNA遺傳多樣性分析,結(jié)果表明病原物種類有 S.scabies、S.galilaeus、S.bobili、S.turgidiscabies、S.acidiscabies、S.diastatochromogenes、S.setonii、S.enissocaesilis,其中 S.galilaeus、S.bobili和 S.enissocaesilis均為新發(fā)現(xiàn)的瘡痂病病原。同時(shí)不同省份的瘡痂病病原種類不同,這說(shuō)明中國(guó)馬鈴薯瘡痂病菌存在明顯的遺傳多樣性,且分布較為復(fù)雜。目前,在新疆還未見(jiàn)相關(guān)馬鈴薯瘡痂病病原鑒定和防治的報(bào)道。本研究首次在新疆伊犁地區(qū)分離到了6株馬鈴薯瘡痂病菌,采用生理生化特性鑒定和16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定,以求明確其具體種類,確定其與國(guó)內(nèi)其他省份馬鈴薯瘡痂病的關(guān)系和來(lái)源,從而為該病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病樣來(lái)自于2008年6月新疆伊犁地區(qū)市場(chǎng)上出售的表面帶有痂狀病斑的馬鈴薯。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離純化

將病薯用蒸餾水洗凈,用解剖刀切取約5 mm的病健交界處的薯塊,于乙醇溶液(75%)中浸泡約30 s,用無(wú)菌水沖洗3遍,再將其置于研缽中加適量無(wú)菌水進(jìn)行充分研磨,然后用接種環(huán)在燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OMA)(燕麥片30 g,煮沸30 min,加瓊脂15 g后用水定容至1 L)上劃線。經(jīng)3次純化培養(yǎng)后,選取6個(gè)菌株作為供試菌株。

1.2.2 致病性測(cè)定

1.2.2.1 菌懸液的制備

將純化后的菌株在燕麥瓊脂培養(yǎng)基平板上活化后,挑取單菌落接種于盛有培養(yǎng)基 ISP1的試管中,將其封好并作好標(biāo)記,置于28℃、180 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)3 d,用無(wú)菌水稀釋后制成1×106CFU/mL左右的菌懸液用于致病性測(cè)定。

1.2.2.2 測(cè)定方法

分離物致病性的測(cè)定分別參照小薯片法[9]和蘿卜幼苗法[10]。

1)小薯片法:選擇健康的感病馬鈴薯、甘薯、胡蘿卜和蘿卜(直徑約4～5 cm),先用75%的乙醇溶液進(jìn)行表面消毒,然后用無(wú)菌打孔器(直徑1.5 cm)打取以上接種體的中心部分,將圓柱狀的接種體切成厚2 mm左右的圓片,放在有無(wú)菌濾紙保濕的培養(yǎng)皿中,每皿4片;將在OMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的待測(cè)菌株切取0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊,倒置接種于接種體上;于27℃的恒溫箱中黑暗培養(yǎng),7 d后觀察結(jié)果,以接種體圓片的壞死大小作為致病性指標(biāo);

2)蘿卜幼苗檢測(cè)法。

將蘿卜籽先用75%的乙醇溶液浸泡約10 min,用無(wú)菌水沖洗3遍,晾干,在以無(wú)菌濾紙保濕的培養(yǎng)皿中催芽16 h,選擇萌發(fā)一致的籽粒放入裝有200 mL 1%瓊脂培養(yǎng)基的組培瓶,每瓶12粒;接種800 μL菌懸液,以未接菌的作為對(duì)照,于24℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 d后取出測(cè)量幼苗長(zhǎng)度。以接種幼苗長(zhǎng)度的平均值與對(duì)照幼苗長(zhǎng)度平均值的百分比作為菌株的抑制率,以此作為致病性指標(biāo)。以上每種方法均3次重復(fù)。

1.2.3 病原菌生物學(xué)特性的測(cè)定

病原形態(tài)特征觀察:用挑針輕輕挑下在水瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的菌落,置于載玻片上,輕輕涂勻然后用結(jié)晶紫染色約1 min,在油鏡下觀察病菌孢子鏈和孢子的形態(tài)特征。

菌株的碳源利用、氮源利用、對(duì)淀粉的利用和硫化氫氣體的產(chǎn)生等參照Lambert等[11-12]和 Miyajima等[13]的方法測(cè)定。其它鑒定指標(biāo)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

1.2.4 16S rDNA序列擴(kuò)增及同源性分析

菌株基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[15]中的方法進(jìn)行。采用鏈霉菌16S rDNA通用擴(kuò)增引物,引物序列 pA:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′,p H:5′-AAG GAG GTG ATC CA G CCG CA-3′。

PCR反應(yīng)體系為:10×buffer:5μL;0.2 mmol/L DNTP:4μL;1.5 mmol/L MgCl2:3μL;0.2 μmol/L pA 5μL;0.2μmol/L p H 5μL;1 U Taq DNA聚合酶:2μL,模板:1μL,然后用雙蒸水補(bǔ)足50μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min,95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min 20 s,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸6 min。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

將擴(kuò)增出的16S rDNA片段交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測(cè)序。將所得序列校對(duì)后,在 NCBI的 GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì),選取與各菌株相似性較高的鏈霉菌菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),利用發(fā)育樹(shù)對(duì)瘡痂病菌進(jìn)行分類,同時(shí)比較各測(cè)試菌株間的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1。

用小薯片法進(jìn)行菌株致病性檢測(cè)時(shí),分別在馬鈴薯、甘薯、胡蘿卜和蘿卜上接種,7 d后,致病菌株均能在接種體上定殖生長(zhǎng),菌片與接種體粘連并使接種體產(chǎn)生褐色的壞死斑,且壞死程度重;而致病性弱的菌株雖然能在接種體上生長(zhǎng),但使接種體的壞死程度輕。在用蘿卜幼苗法檢測(cè)時(shí),致病菌株能顯著抑制幼苗的生長(zhǎng),抑制率為28.4%～70.8%。

表1 致病性測(cè)定結(jié)果Tab.1 The result of isolates pathogenicity

2.3 病原菌生物學(xué)特性的測(cè)定

通過(guò)對(duì)6個(gè)馬鈴薯瘡痂病菌進(jìn)行生物學(xué)特性的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)不同病菌的培養(yǎng)性狀差別較大(表2)。

表2 馬鈴薯瘡痂病菌的生物學(xué)特性Tab.2 Characteristics of potato scab strains and other Streptomyces species and strains

根據(jù)各菌株對(duì) ISP(international streptomyces project)中的碳源(阿拉伯糖、棉子糖、甘露糖、木糖、果糖、鼠李糖等)的利用、對(duì)氮源的利用和硫化氫氣體的產(chǎn)生等生物學(xué)特征可將本研究中的測(cè)試菌株分為 2 組(表 2)。

I組:孢子絲呈自由彎曲狀,孢子白色、光滑,產(chǎn)生黃褐色可溶性色素,不產(chǎn)生黑色素;能以ISP中的所有糖類為單一碳源,能以甲硫氨酸、組氨酸為單一氮源,對(duì)青霉素(10 IU/mL)、鏈霉素(20μg/mL)、苯酚(0.1%)、結(jié)晶紫(0.5μg/mL)不敏感,產(chǎn)生硫化氫氣體;該組菌株(Scx-1～Scx-5)的生物學(xué)特性與已報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病菌株S.acidiscabies基本相同。

II組:孢子絲呈自由彎曲狀,孢子灰色、光滑,產(chǎn)生可溶性色素,可產(chǎn)生黑色素;不能以ISP中的鼠李糖和蔗糖為單一碳源,能以組氨酸為單一氮源,但不能以甲硫氨酸為單一氮源,對(duì)青霉素(10 IU/mL)、苯酚(0.1%)、鏈霉素(20μg/mL)、結(jié)晶紫(0.5μg/mL)不敏感,不產(chǎn)生硫化氫氣體。該組菌株(Scx-6)與已報(bào)道的S.scabies菌株的生物學(xué)特性較為接近。

2.4 16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

以pA和p H為引物,對(duì)本研究中的所有菌株的基因組進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果均能擴(kuò)增出約1.5 kbp的16S rDNA片段。本研究選取 Scx-1、Scx-3、Scx-6三菌株的16S rDNA片段進(jìn)行測(cè)序(圖1),通過(guò)在NCBI GenBank中進(jìn)行Blast比較,證明均為鏈霉菌的16S rDNA序列。

圖1 16S rDNA片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of PCR amplification for 16S rDNA sequences

2.5 基于16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

選取在 GenBank中Blast比較時(shí)與各測(cè)序菌株相似性較高的菌株及鏈霉菌種的幾個(gè)典型種菌株,利用DNAStar 5.0序列分析軟件構(gòu)建發(fā)育樹(shù)(圖2),對(duì)各菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)菌株Scx-6與美國(guó)的菌株S.scabies(序列號(hào):ATCC 49173)的同源性為100%,Scx-1和 Scx-3與 S.acidiscabies(序列號(hào):ATCC 49003)的同源性為99.8%。

圖2 鏈霉菌的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences ofStreptomyces

3 討論

通過(guò)對(duì)供試菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生理生化反應(yīng)的觀察和測(cè)定,同時(shí)結(jié)合16S rDNA序列分析,將引起新疆馬鈴薯瘡痂病的病原鑒定為 S.acidiscabies和S.scabies,且 S.acidiscabies的致病力明顯強(qiáng)于 S.scabies。但鑒定為 S.acidiscabies的Scx-5菌株致病力相對(duì)其它菌株較弱,可能是菌株本身遺傳特性上存在差異,需進(jìn)一步研究證實(shí)。

馬鈴薯瘡痂病菌還可以侵染蘿卜、甜菜等其它作物,本研究選用蘿卜幼苗法和小薯片法對(duì)菌株進(jìn)行致病性測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這2種方法檢測(cè)時(shí)均能表現(xiàn)出抑制蘿卜幼苗的生長(zhǎng)和使小薯片產(chǎn)生壞死等癥狀,說(shuō)明所有菌株均有致病能力。另外,本研究對(duì)菌株的生物學(xué)特性測(cè)定發(fā)現(xiàn)所有菌株對(duì)青霉素、苯酚、鏈霉素等均不敏感,與已報(bào)道的 S.scabies和 S.acidiscabies菌株的特性不太一致,這也是需要進(jìn)一步探索的重點(diǎn)。在新疆可能還存在其他種類的馬鈴薯瘡痂病菌類群,但是由于本研究所采集菌株的范圍和數(shù)量有限。為了防止該病害在新疆馬鈴薯上的進(jìn)一步擴(kuò)展和蔓延,保證新疆馬鈴薯產(chǎn)物的可持續(xù)發(fā)展,有必要對(duì)新疆發(fā)生的馬鈴薯瘡痂病進(jìn)行全面的調(diào)查和病原鑒定工作。

[1]Loria R,Bukhalid R A,Fry B A,et al.Plant pathogenicity in the genusStreptomyces[J].Plant Disease,1997,81:836-846.

[2]Wanner L A.A survey of genetic variation inStreptomyces isolates causing potato common scab in the United States[J].Phytopathology,2006,96:1363-1371.

[3]Park D H,Yu YM,KimJ S,et al.Characterization ofStreptomycetescausing potato common scab in K orea[J].Plant Disease,2003,87:1290-1296.

[4]Kreuze J F,Suomalainen S,Paulin L,et al.Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes and PCR analysis of the nec1 gene from Streptomycesspp.causing common scab,pitted scab,and netted scab in Finland[J].Phytopathology,1999,89:462-469.

[5]Groth I,Schütze B,Boettcher T.Kitasatospora putterlickiae sp.nov.,isolated from rhizosphere soil,transfer ofStreptomyces kif unensisto the genusKitasatosporaasKitasatospora kif unensiscomb.nov.,and emended description ofStreptomyces aureof aciensDuggar 1948[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2003,53:2033-2040.

[6]Wanner L A.A new strain of Streptomyces causing common scab in potato[J].Plant Disease,2007,91(4):352-359.

[7]趙偉全,楊文香,李亞寧,等.中國(guó)馬鈴薯瘡痂病菌的鑒定[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(2):313-318.

[8]張萌,趙偉全,于秀梅,等.中國(guó)馬鈴薯瘡痂病病原菌16 S rDNA的遺傳多樣性分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(2):499-504.

[9]Loria R,Bukhalid R A,Creath R A,et al.Differential production of thaxtomins by pathogenicStreptomyces species in vitro[J].Phytopathology,1995,85:537-541.

[10]Leiner R H,Fry B A,Carling D E,et al.Probable involvement of thaxtomins A in pat hogenicityofStreptomyces scabieson seedlings[J].Phytopathology,1996,86:709-713.

[11]Lambert D H,Loria R.Streptomyces scabiessp.nov.,nom.rev[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1989,39:387-392.

[12]Lambert D H,Loria R.Streptomyces acidiscabiessp.nov[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1989,39:393-396.

[13]Miyajima K,Tannaka F,Takeuchi T,et al.Streptomyces turgidiscabiessp.nov[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1998,48:495-502.

[14]中國(guó)科學(xué)院微生物研究所伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)翻譯組.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984.

[15]Kieser T,Bibb M J,Buttner M J,et al.PracticalStreptomycesGenetics[M].Norwich:The John Innes Foundation,2000.

Identification of Pathogen on Potato Scab in Xinjiang

DU Juan,REN Juan,ZHAO Sifeng,REN Yuzhong
(The Key Laboratory of Prevention and Control for Oasis Crop Disease,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S435.32;TQ351.376

A

1007-7383(2010)04-0414-04

2009-08-29

杜娟(1979-),女,助理實(shí)驗(yàn)師,碩士生,從事植物植物病理學(xué)研究;e-mail:dujuanshzdx@126.com。

任毓忠(1970-),男,副教授,從事植物細(xì)菌病害及病害流行學(xué)研究;e-mail:ryzh?agr@shzu.edu.cn。