六倍體小黑麥耐鹽相關(guān)基因cDNA-AFLP技術(shù)體系的建立

王白羽,任麗彤,曹連莆,孔廣超

(石河子大學(xué)麥類作物研究所,石河子 832003)

六倍體小黑麥耐鹽相關(guān)基因cDNA-AFLP技術(shù)體系的建立

王白羽,任麗彤,曹連莆,孔廣超

(石河子大學(xué)麥類作物研究所,石河子 832003)

為建立和優(yōu)化六倍體小黑麥耐鹽相關(guān)基因克隆cDNA-AFLP技術(shù)反應(yīng)體系,并探索其應(yīng)用效果,以對鹽脅迫反應(yīng)不同的4個六倍體小黑麥品種(系)為材料,對其在0.15 mol/L氯化鈉脅迫72 h的cDNA-AFLP技術(shù)中DNA聚合酶濃度、模版濃度和引物篩選等過程進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。結(jié)果顯示,建立了以1.0 U Taq DNA聚合酶為擴(kuò)增酶、預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋20倍、EcoR I和Mse I為內(nèi)切酶及其相應(yīng)接頭為引物的六倍體小黑麥耐鹽相關(guān)基因cDNAAFLP技術(shù)體系,并從64對引物組合中篩選出穩(wěn)定、高效的引物組合以及236個差異片段。結(jié)果表明,該cDNAAFLP技術(shù)體系更易分離出差異性片段,為六倍體小黑麥在鹽脅迫及其它逆境環(huán)境下的基因克隆提供一種有效手段。

小黑麥;耐鹽基因;cDNA-AFLP;差異性片段

Abstract:To construct a more efficient cDNA-AFLP system and explore its usage for gene clone related with salt stress in triticale.Four triticale varieties or lines with sensitive or tolerant to salt were used to be stressed by 0.15 mol/L NaCl for 72 hours as materials,the courses of DNA Polymerase concentration,template concentration,primer screening in the cDNA-AFLP technolyge were optimized.The result showed that we constructed the cDNA-AFLP system that 1.0 U Taq DNA polymerase for pre-amplication enzyme,the 20 times of diluted pre-amplication product,EcoR I and Mse I and their realted adapters for primers,and several stable,edible primer combinations were screened out of 64 pairs of primers and 236 differentially expressed cDNAs were obtained with the newly established cDNA-AFLP system.The result indicated that cDNA-AFLP could easily isolate more differential cDNAfragments than usual AFLP techniques and it will provide a powerful method for molecular cloning of genes in triticale related with salt stress.

Key words:triticale;salt stress;cDNA-AFLP;differentially expressed cDNAs

鹽堿是影響全球大田作物持續(xù)生產(chǎn)的主要非生物逆境之一,它影響了作物的正常生長,限制了作物產(chǎn)量潛力的正常發(fā)揮。據(jù)統(tǒng)計,在影響作物產(chǎn)量的各種環(huán)境因素中,干旱和鹽堿所造成的減產(chǎn)損失高達(dá)40%以上[1]。全球約有9億hm2的土地存在不同程度的鹽堿化,占世界總耕地面積的20%,其中中國鹽堿土面積約2000萬hm2[2]。因此,如何開發(fā)和利用鹽堿化土壤,提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)已成為鹽堿地農(nóng)業(yè)、海水灌溉農(nóng)業(yè)中亟待解決的重要問題[3]。

小黑麥?zhǔn)怯尚←満秃邴溄?jīng)屬間人工雜交、應(yīng)用染色體加倍技術(shù)育成的第一個新物種[4]。其不僅具有小麥籽粒高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的特性,也繼承了黑麥生物學(xué)產(chǎn)量高,對病、蟲害以及干旱、瘠薄、鹽堿等不良環(huán)境條件耐性較強(qiáng)的優(yōu)點。小黑麥的耐鹽堿性及其生物改良鹽堿地的作用日益受到關(guān)注[5]。但長期以來人們對小黑麥耐鹽機(jī)理知之甚少。從基因表達(dá)的差異入手,尋找與小黑麥耐鹽性相關(guān)的基因,并對其功能進(jìn)行分析,對于深入了解小黑麥耐鹽堿機(jī)理具有重要的意義。

cDNA-AFLP(cDNA amplifiedfragment length polymorphism)是Bachem等[6]在基因組DNA的選擇性擴(kuò)增限制性片段即AFLP(amplified fragment length polymorphism)的基礎(chǔ)上創(chuàng)造出來的一種用于RNA指紋分析的方法,該法將 RT-PCR(reverse transcripted PCR)和AFLP技術(shù)結(jié)合起來,采用 PCR中較高的退火溫度和特定引物對包含信息較多的內(nèi)部特異片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,從而增加了反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)度,使其比 DDRT-PCR(differential display reverse transcriptase PCR)的可靠性和可重復(fù)性大大提高[7]。

本研究以六倍體小黑麥為材料,通過對限制性酶切及連接、PCR預(yù)擴(kuò)增、選擇性PCR擴(kuò)增過程的摸索,旨在優(yōu)化小黑麥耐鹽相關(guān)基因cDNA-AFLP技術(shù)反應(yīng)體系,并從中篩選穩(wěn)定、高效的引物組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

供試的4個六倍體小黑麥品種(系)為新小黑麥3號、新小黑麥 5 號、98-5981、28ITSN-51,均為石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院麥類育種課題組提供。其中新小黑麥3號、新小黑麥5號在前期研究中表現(xiàn)為耐鹽堿品種,而98-5981和28ITSN-51對鹽堿反應(yīng)表現(xiàn)較為敏感。

本研究使用的脅迫前后的RNA模板為4個品種等比例混合的RNA。

1.1.2 主要試劑

Trizol試劑購自 TIAN GEN生物技術(shù)公司(北京),cDNA合成試劑盒購自 Takara生物技術(shù)公司(大連)。所用DNA限制性內(nèi)切酶 EcoRI、MseI以及 T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、接頭及引物都來自購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的AFLP試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫處理

將4個小黑麥品種(系)的種子在發(fā)芽盒中進(jìn)行發(fā)芽,待長到一葉期時,轉(zhuǎn)至培養(yǎng)盒中用 Hoagland營養(yǎng)液水培7 d左右[8],長至二葉一心后分為2組,一組采用0.15 mol/L氯化鈉脅迫處理72 h,另一組(未脅迫)為對照。

1.2.2 RNA的提取

分別采集經(jīng)氯化鈉脅迫和對照組的新鮮、幼嫩葉片,利用 Trizol法提取 RNA[9]。

1.2.3 cDNA的獲得

采用反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒將獲得的RNA合成雙鏈cDNA[10],做為AFLP分析模板。

以管家基因Actin為內(nèi)參,檢測所合成cDNA模板的質(zhì)量,正義引物為:GGAAAAGTGCAGAGAGACACG,反義引物為:TACAGTGTCTGGATCGGTGGT[11],擴(kuò)增出目的片段后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 酶切連接與預(yù)擴(kuò)增模板的制備

采用EcoRⅠ和MseⅠ酶對cDNA樣品進(jìn)行雙酶切,后用EcoRⅠ和MseⅠ接頭連接,制備預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)模板,并對酶濃度和預(yù)擴(kuò)增模板濃度進(jìn)行梯度設(shè)計。

1.2.6 選擇性擴(kuò)增

各選用8個 EcoRⅠ和MseⅠ引物,組合成64對選擇性擴(kuò)增引物,其序列如下:E+CA、E+CT、E+CC、E+CG、E+AG、E+GC、E+AC、E+GG、M+TT、M+TA、M+TC、M+TG、M+AA、M+AT、M+AC、M+AG。

1.2.7 凝膠電泳

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳,驗證是否有產(chǎn)物以及產(chǎn)物分子量大小范圍后,采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物分離[12]。

1.2.8 銀染顯色

寧夏地處我國西部地區(qū)，是少數(shù)民族聚居區(qū)，也是典型的欠發(fā)達(dá)省區(qū)。其中，位于南部地帶的西海固地區(qū)是國家14個集中連片特困地區(qū)之一，也是被習(xí)近平總書記深切關(guān)注，稱為“苦瘠甲天下”的貧瘠地區(qū)。近年來，寧夏扶貧工作取得顯著成績，但仍有15萬戶建檔立卡貧困戶、58萬建檔立卡貧困人口，且每年因病、因殘致貧高達(dá)4萬余戶，每年因病、因災(zāi)、因意外再次返貧的人口也高達(dá)1萬余戶。隨著較易脫貧的人口逐步完成脫貧，扶貧開發(fā)工作邁入“深水區(qū)”，如何解決剩余貧困人口的脫貧問題，成為脫貧攻堅工程的重點。

在文獻(xiàn)[13]中方法的基礎(chǔ)上,對硝酸銀的用量、銀染時間以及顯影的用量及操作作了改進(jìn),即銀染液為1.6 g AgNO3+1.5 mL甲醛+1 L去離子水,染色時間為25 min,顯影時間縮短為5 min左右。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA的合成

利用 Trizol法所提取的六倍體小黑麥RNA經(jīng)電泳分析,結(jié)果(圖1)表明:所提取的RNA完整,無拖尾和降解現(xiàn)象,也無明顯的DNA和蛋白質(zhì)殘留,且其OD260/OD280值均為1.8～2.0。

用反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA,以Actin引物擴(kuò)增目的片段,電泳后在150 bp出現(xiàn)較亮的條帶(圖2),即Actin基因。這表明所提取的cDNA完整,且其質(zhì)量良好,同時由 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA獲得了成功,這些均表明由其反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA適于AFLP標(biāo)記的分析。

圖1 提取的小黑麥RNA的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis pattern of RNA from tirticale

圖2 合成的cDNA質(zhì)量電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of cDNA from tirticale

2.2 Taq DNA聚合酶濃度對預(yù)擴(kuò)增結(jié)果的影響

設(shè)定4個 Taq DNA聚合酶濃度梯度為0.6、0.8、1.0、1.2 U。由圖3可見,當(dāng) Taq DNA 聚合酶為0.8 U和1.0 U時,均在500～250 bp處出現(xiàn)了彌散帶,而在其他濃度時,均沒有擴(kuò)增到產(chǎn)物。這表明0.8 U和1.0 U的Taq DNA聚合酶較為理想。

在以上 Taq DNA聚合酶濃度的基礎(chǔ)上,最終建立了AFLP預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系:2.0μL模板,1.0 μL Pre-ampmix(10μmol/μL),2.5μL 10×Buffer,0.5μL dNTP(2.5 mmol/L),0.5μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL),18.5μL水。

反應(yīng)程序:94℃2 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃,80 s,30個循環(huán);72℃5 min。

2.3 模板濃度對選擇性擴(kuò)增的影響

AFLP技術(shù)對模板質(zhì)量要求較高,而模板DNA的量在數(shù)十倍的范圍內(nèi)變動都不會對擴(kuò)增的結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。如圖4所示,預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物在稀釋20倍和50倍后分別作為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增時,擴(kuò)增結(jié)果基本上一致。而稀釋50倍的預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物在重復(fù)試驗時擴(kuò)增效果不穩(wěn)定,因此選擇稀釋20倍預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物作為模板為宜。

圖3 不同Taq DNA聚合酶濃度預(yù)擴(kuò)電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis pattern for the products of PCR amplification under different Taq DNA polymerase concentration

圖4 預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋不同倍數(shù)的選擴(kuò)圖譜Fig 4 Electrophoresis pattern for the products of PCR amplification under different preamplication products concentration

在此基礎(chǔ)上建立了適合的AFLP選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系:3.0μL模板,0.8μL EcoRⅠ選擴(kuò)引物(10μmol/L),0.8μL MseⅠ選擴(kuò)引物 (10μmol/L),2.5μL 10×Buffer,0.45μL dNTP(10 mmol/L),0.31μL Taq DNA 聚合酶(2 U/μL),12.324 μL水。

反應(yīng)程序:94℃2 min;94℃30 s,65℃30 s,72℃80 s,退火溫度每個循環(huán)降0.7℃、14個循環(huán);94℃30 s;55℃30 s;72℃80 s,23個循環(huán);72℃5 min。

2.4 引物篩選

由圖5可知,E+CC/M+A G、E+CT/M+AG等引物可以擴(kuò)增出較穩(wěn)定的條帶。圖5還顯示挑選差異片段的5種情況:

1)在鹽脅迫處理和對照中的表達(dá)無明顯的差異,如圖5中的第7和第8泳道;

2)某一基因在對照中的表達(dá)比在鹽脅迫處理的樣品強(qiáng),例如圖5中的A指示的譜帶;

3)某一基因在樣品中的表達(dá)比對照強(qiáng),例如圖5中B指示的譜帶;

4)某一基因在對照中表達(dá)而在鹽脅迫后不表達(dá),例如圖5中C所指示的譜帶;

5)某一基因鹽脅迫后才表達(dá),而在對照樣品中無表達(dá),例如圖5中的D所指示的譜帶。

圖5 不同引物的聚丙烯凝膠電泳圖譜Fig.5 Polyacrylamide electrophoresis pattern for the products of amplified by different primers

2.5 差異片段比對

經(jīng)64對引物的篩選共挑選出了236個差異片斷(表1),從中隨機(jī)選取100個進(jìn)行二次擴(kuò)增,已成功擴(kuò)增并克隆、測序的差異性片段共33個,其它的可能為假陽性。

表1 篩選出的具差異性引物組合及差異片段數(shù)目Tab.1 The screened different primer combinations and differentially expressed cDNAs

將這33個片段在NCBI中通過Blast-X比對,結(jié)果表明:有30個與已知特定基因具有同源性,另有3個未找到具有同源性的已知基因或序列無任何同源性,可能是尚未發(fā)現(xiàn)的新基因。在30個已知基因的同源片段中有5個與耐鹽性密切相關(guān),如磷酸酰絲氨酸脫羧酶、谷氨酰胺依賴天冬酰胺合成酶、碳酸酐酶、抗性蛋白;其余的25個片段分別與高分子量麥谷蛋白基因,光系統(tǒng)II 32kDa蛋白,光系統(tǒng)I疏水蛋白(PSI)等基因具有同源性。

3 討論

在cDNA-AFLP技術(shù)中,當(dāng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物高度表達(dá)時,擴(kuò)增條帶強(qiáng)度的高低能直接反應(yīng)出基因表達(dá)量的差別,所獲得的轉(zhuǎn)錄衍生片段可最大限度的提供基因編碼區(qū)的信息,這使得cDNA-AFLP技術(shù)成為一種分離差異表達(dá)基因的有效方法[14]。

影響cDNA-AFLP結(jié)果的因素有很多,如 Taq DNA聚合酶的濃度、預(yù)擴(kuò)模板的濃度、限制性內(nèi)切酶的組合等。其中選擇限制性內(nèi)切酶的組合是最難把握的,因為限制性內(nèi)切酶要最大限度地覆蓋mRNA池,這樣才可以涵蓋所有表達(dá)基因的信息[15],也就要求對作物的遺傳信息有更全面的了解。

本研究建立了以 Trizol法提取RNA、1.0U北京鼎國生物技術(shù)有限公司的 Taq DNA聚合酶為與擴(kuò)增酶、預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋20倍、EcoR I和 Mse I為內(nèi)切酶及其相應(yīng)接頭引物為主要技術(shù)內(nèi)容,同時結(jié)合增加 AgNO3用量以及縮短顯色時間的cDNAAFLP技術(shù)體系。該技術(shù)體系比以往在作物上使用的AFLP更易分離出差異性片段,其可靠性和可重復(fù)性也有了較大提高[15],同時突破了常規(guī)的銀染染色方法,所得的小黑麥圖譜條帶清晰、背景色淡,其染色結(jié)果更利于數(shù)據(jù)的分析。

本實驗利用cDNA-AFLP技術(shù)從小黑麥中克隆了一些與鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)的cDNA片段,它們有可能在小黑麥的耐鹽中起重要或決定性作用。獲得的這些基因根據(jù)已知的 EST序列進(jìn)行了部分基因的全長cDNA的克隆,獲取了抗鹽堿相關(guān)基因碳酸酐酶,其與在 GenBank公布的大麥碳酸酐酶基因的同源性為79%,這為進(jìn)一步研究小黑麥鹽堿相關(guān)基因奠定了一定基礎(chǔ)。

該cDNA-AFLP技術(shù)是首次應(yīng)用于小黑麥分子標(biāo)記方面,不僅適合小黑麥逆境環(huán)境下基因的差異性片段分離,也可為研究其它麥類作物通過RNA反轉(zhuǎn)錄和差顯途徑進(jìn)行基因分子克隆提供參考。

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Contruction of cDNA-AFLP Technique for Genes Related to Salt Stress in Hexopliod Tirticale

WANGBaiyu,REN Litong,CAO Lianpu,KONG Guangchao
(Institute of Triticeae Crops,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S512.4

A

1007-7383(2010)04-0404-05

2009-10-11

國家自然科學(xué)基金項目(30960194)

王白羽(1984-),女,碩士生,專業(yè)方向為作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性性狀的育種。

孔廣超(1970-),男,副教授,從事作物遺傳育種研究;e-mail:kgch_agr@shzu.edu.cn。