黑果枸杞葉總黃酮的體外抗氧化活性研究

李 進(jìn)，李淑珍，馮文娟，原 慧

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，新疆珍稀瀕危物種保護(hù)生物學(xué)實驗室，新疆 烏魯木齊 830054)

黑果枸杞葉總黃酮的體外抗氧化活性研究

李 進(jìn)，李淑珍，馮文娟，原 慧

(1.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，新疆珍稀瀕危物種保護(hù)生物學(xué)實驗室，新疆 烏魯木齊 830054)

通過測定黑果枸杞葉總黃酮的還原能力，以及對小鼠血清羥自由基清除能力、小鼠紅細(xì)胞溶血性、小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響，探討黑果枸杞總黃酮的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：黑果枸杞總黃酮在化學(xué)本質(zhì)上具有一定的抗氧化能力，能顯著抑制小鼠紅細(xì)胞溶血，IC50為0.124mg/mL；能增強(qiáng)小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成，并顯示出一定的量效關(guān)系。說明黑果枸杞葉總黃酮在一定濃度范圍內(nèi)具有抗氧化活性。

黑果枸杞葉；總黃酮；抗氧化；體外

黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)是茄科枸杞屬的多年生耐鹽、抗旱灌木，分布于我國西北地區(qū)，是民族醫(yī)藥中的常用藥材，藏醫(yī)以其成熟的果實入藥，治療心熱病、心臟病等病癥[1]；而維吾爾醫(yī)常用黑果枸杞果實及根皮治療尿道結(jié)石、癬疥、齒齦出血等癥，民間作滋補(bǔ)強(qiáng)壯以及降壓藥[2]。目前對于黑果枸杞的研究多集中于其果實所含色素和多糖的提取和生物活性方面[3-6]，而對其葉片中黃酮物質(zhì)的研究未見報道。因此，本實驗探討黑果枸杞葉片中總黃酮在體外生物模擬體系中的抗氧化活性，以為中藥數(shù)據(jù)庫的建立提供信息資料，同時也為其作為抗氧化藥物或食品抗氧化劑開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本實驗所用材料為黑果枸杞的葉片，采自新疆石河子144團(tuán)，材料經(jīng)過粉碎后，過35目篩，置于干燥器中備用。

所用試劑均為分析純級。

2800UV型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；FA 1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫干燥箱 上海第三分析儀器廠；RE-52旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-82 型水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉醫(yī)療器械廠；HL-2S恒流泵 上海康華生化儀器制造廠；TDL-60B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；玻璃組織勻漿器等。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞葉總黃酮的制備

取經(jīng)過脫脂處理的黑果枸杞葉片粉末，用20倍量60%乙醇溶液在60℃浸提40min，抽濾，得到澄清提取液，減壓濃縮回收乙醇，得到無乙醇味的濃縮液，經(jīng)水適當(dāng)稀釋后，流經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，再用95%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓蒸餾，真空干燥即得淡黃色總黃酮粉未[7]。

1.2.2 黑果枸杞葉總黃酮還原力的測定

取2.5mL樣品(質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.2mg/mL)于試管中，依次加入2.5mL的0.2mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH 6.6)和2.5mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%六氰合鐵酸鉀溶液(K3Fe(CN)6)，于50℃水浴保溫20min后，快速冷卻，再加入2.5mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液(TCA)，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液2.5mL，依次加入4mL蒸餾水，1mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液(FeCl3)，充分混勻，靜置10min后，在700nm下測定其吸光度A700nm(以蒸餾水做參比液)，吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)[6]。

1.2.3 黑果枸杞葉總黃酮對小鼠血清羥自由基清除能力的影響

分別取0.1mL小鼠血清用含有不同質(zhì)量濃度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)黃酮樣品的生理鹽水稀釋20倍，于37℃溫浴1h后，吸取0.2mL直接按照羥自由基測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)方法測定A550nm，計算羥自由基清除能力。并以反應(yīng)體系中樣品濃度作對體系的羥自由基清除能力的變化曲線[6,8]。

1.2.4 黑果枸杞葉總黃酮對紅細(xì)胞保護(hù)作用

小鼠眼眶取血，肝素抗凝全血，用生理鹽水2000r/min 15min離心洗滌3次，去除血漿后，以生理鹽水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的紅細(xì)胞懸液，加入0.1mL不同質(zhì)量濃度(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.2mg/mL)的樣品溶液，混勻后，再加入0.1mL 100mmoL/L H2O2，37℃下保溫1h，然后用4mL生理鹽水稀釋，2000r/min離心5min，取上清液測415nm處的吸光度(A1)?？瞻坠芤?.1mL 生理鹽水代替樣品液，其余操作同樣品管，測得空白管吸光度(A0)[9-10]。

樣品對紅細(xì)胞溶血的半抑制量(IC50)是指對紅細(xì)胞溶血抑制率達(dá)到50%時的樣品質(zhì)量濃度。

1.2.5 黑果枸杞葉總黃酮對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響

取小鼠脫頸椎處死，迅速取肝臟組織以0～4℃的生理鹽水洗凈血漬，以濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，按1:9取相應(yīng)體積的0～4℃生理鹽水于冰浴中將肝組織剪碎、在玻璃勻漿器中制成勻漿液，以3500 r/min離心15min，上清液即為10%肝組織勻漿液。

取0.2mL 10%肝勻漿液和0.1mL 不同含量(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.2mg/mL)黃酮樣品溶液于試管中混勻，作為測定管，37℃溫浴1h(對照以等體積生理鹽水代替樣品溶液)后，冰浴冷卻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液0.2mL，混勻后再分別加入1.5mL 0.2mol/L醋酸鹽緩沖液(pH3.5)和1.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液，最后加入0.5mL 雙蒸水，混勻，避光沸水浴60min，取出后流水冷卻至室溫，測定波長532nm 處的吸光度(Au)。另外分別取0.3mL 10nmol/mL的四乙氧基丙烷(TEP)對照品溶液和生理鹽水作為對照管、空白管，其余操作同測定管，以生理鹽水做對照調(diào)零，于波長532nm 處測定標(biāo)準(zhǔn)管吸光度(As)和空白管吸光度(A0)。

式中：C為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA濃度/(nmol/mL)；c為對照品濃度/(nmol/mL)；V0為對照品體積/mL；V為測定樣品體積/mL；n為組織樣測試前稀釋倍數(shù)。

由此按式(4)計算樣品的抑制率。

式中：c為含抗氧化劑樣品中MDA濃度/(nmol/mL)；c0為空白樣品中MDA濃度/(nmol/mL)。

另取1 組試管分別測定黃酮樣品對H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿產(chǎn)生MDA的影響。加入0.1mL 的100mmol/L H2O2，然后各管加0.1mL的10 %肝勻漿液及0.1mL的相應(yīng)濃度黃酮溶液混勻，于37℃溫浴1h(對照以等體積生理鹽水代替黃酮樣品溶液)，其余步驟同前[6,11]。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，以SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，各組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞葉總黃酮還原能力

為了確定黑果枸杞葉總黃酮具有抗氧化性，首先對其還原力進(jìn)行測定。還原力是檢驗樣品是否為一良好的電子供應(yīng)者(electron donors)，一般情況下，樣品的還原能力與其抗氧化活性之間有顯著的正相關(guān)性，還原力的高低可以反映抗氧化能力的強(qiáng)弱[12]。

圖1 黑果枸杞葉總黃酮還原力Fig.1 Reducing power of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr.

從圖1可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，吸光度不斷升高，吸光度越大，其還原能力越強(qiáng)。在本實驗所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，黑果枸杞葉總黃酮的還原力隨其質(zhì)量濃度的增大而增大?？梢姾诠坭饺~總黃酮為良好的電子供應(yīng)者，他所提供的電子可使Fe3+還原為Fe2+，說明黑果枸杞葉黃酮類物質(zhì)具有抗氧化潛力。

2.2 黑果枸杞葉總黃酮對小鼠血清羥自由基清除能力的影響

無核紅寶石葡萄避雨栽培，傷流期、萌芽期與露地栽培基本一致，其他物候期都發(fā)生了相應(yīng)變化；病蟲鳥害發(fā)生程度減輕，大大減少了噴藥次數(shù)和用工數(shù)量；減少了雨水對肥料的沖刷，提高了肥料利用率；減輕了裂果。在產(chǎn)量相同條件下，避雨栽培的無核紅寶石葡萄優(yōu)質(zhì)果率可達(dá)到91%，可作為無公害或綠色果品出售，平均售價比露地高3.8元/kg，每畝比露地栽培增收0.8萬元。

自由基對生物大分子有損傷作用，對蛋白質(zhì)的主要作用是修飾氨基酸殘基，引起結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變，造成肽鏈斷裂、聚合、交聯(lián)等損傷。自由基可使DNA 的氫鍵斷裂、堿基降解和主鏈解旋，所有核酸成分均可受到自由基的攻擊。自由基還對不飽和共價鍵具有一種特殊的親和力，容易攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，從而引起膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。羥自由基是活性氧中化學(xué)性質(zhì)最活潑的自由基，它幾乎與活細(xì)胞中任何生物大分子發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)速度極快，是對機(jī)體危害最大的自由基。血清是機(jī)體內(nèi)重要的抑制羥自由基的組織，如加入外源抗氧化劑，可以增強(qiáng)血清的抗氧化能力[6,8]。

圖2 黑果枸杞葉總黃酮對小鼠血清羥自由基清除能力的影響Fig.2 Scavenging effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on hydroxyl free radicals in mouse serum

由圖2可以看出，黑果枸杞葉總黃酮能增強(qiáng)血清抑制羥自由基的能力，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制羥自由基的能力會增強(qiáng)。說明黑果枸杞葉總黃酮具有抗氧化活性，可以預(yù)測黑果枸杞總黃酮在生物體內(nèi)有較強(qiáng)的抗氧化作用。

2.3 黑果枸杞葉總黃酮對紅細(xì)胞保護(hù)作用

紅細(xì)胞內(nèi)含有啟動和催化脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的金屬絡(luò)合物血紅蛋白，細(xì)胞膜上富含多價不飽和脂肪酸，這些特點均使該類細(xì)胞對氧化損傷極為敏感，當(dāng)向紅細(xì)胞懸液中加入H2O2后，紅細(xì)胞膜會受到氧化損傷，而導(dǎo)致溶血現(xiàn)象的發(fā)生，因此，紅細(xì)胞膜常被用作分析和篩選天然抗氧化劑的實驗體系[6,9]。

圖3 黑果枸杞葉總黃酮對紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on H2O2-induced hemolysis of mouse erythrocytes

從圖3可以看出，黑果枸杞葉總黃酮對紅細(xì)胞溶血有抑制作用，保護(hù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，并在一定濃度范圍內(nèi)顯示出相應(yīng)的量效關(guān)系，IC50=0.124mg/mL。說明黑果枸杞葉總黃酮有螯合金屬離子和有效的減弱體外脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用，它在細(xì)胞水平上具有較好的抗氧化活性，這在某種程度上也預(yù)示著黑果枸杞葉總黃酮在預(yù)防延緩衰老等方面具有一定的應(yīng)用前景。

2.4 黑果枸杞葉總黃酮對小鼠肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響

自由基對生物體的各種氧化損傷中，脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是主要的損傷。自由基攻擊脂質(zhì)體中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化作用。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，一些是無害的，另一些則能引起細(xì)胞代謝及功能障礙，甚至死亡。MDA就是其中一種，它是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發(fā)的脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物。MDA對生物膜產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，直接影響到膜結(jié)構(gòu)和膜流動性，使膜發(fā)生交聯(lián)，脆性增加，MDA的高低間接反應(yīng)了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[13]。

肝臟是反映脂質(zhì)過氧化較為敏感的器官，氧化損傷引起MDA生成量增加。小鼠肝勻漿液中的MDA 含量水平間接反映了脂質(zhì)過氧化的程度。1個MDA分子與2個硫代巴比妥酸分子在酸性條件下共熱， 形成粉紅色復(fù)合物， 該物在波長532nm有最大吸收峰，可以通過測定粉紅色復(fù)合物在波長532nm處的吸光度確定MDA的生成量。通過測定MDA的生成量，可知黑果枸杞總黃酮對脂質(zhì)過氧化具有抑制能力。

圖4 黑果枸杞葉總黃酮對脂質(zhì)過氧化生成MDA的影響Fig.4 Inhibitory effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on MDA generation in mouse liver homogenate by auto-oxidation

圖5 黑果枸杞葉總黃酮對過氧化氫引起的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成量的影響Fig.5 Effect of the total flavonoid extract from the leaves of Lycium ruthenicum Murr. on H2O2-induced MDA generation

從圖4可以看出，在質(zhì)量濃度較低時(0～0.16mg/mL)，黑果枸杞葉總黃酮對小鼠肝勻漿自發(fā)氧化生成MDA有較好的抑制效果，當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.16mg/mL后，對MDA的清除率隨濃度的升高而下降。而對H2O2引發(fā)生成的MDA的清除率(圖5)則隨質(zhì)量濃度的升高而升高。說明在一定含量范圍內(nèi)，黑果枸杞葉總黃酮能有效抑制肝組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，表明其在肝臟器官水平上具有明顯的抗氧化作用。

3 討 論

通過生物體外純化學(xué)反應(yīng)體系實驗表明，黑果枸杞葉總黃酮具有體外抗氧化活性，且抗氧化活力與其濃度存在量效關(guān)系。在與生物大分子相結(jié)合的體外生物模擬反應(yīng)實驗中可以看出，黑果枸杞葉總黃酮在對紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用、對清除小鼠血清羥自由基的影響和抑制小鼠肝臟MDA產(chǎn)生方面都具有顯著功效，表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。

黑果枸杞葉總黃酮的抗氧化活性主要表現(xiàn)在清除自由基和抗脂質(zhì)體過氧化方面。黑果枸杞葉總黃酮清除自由基的原理是該化合物具有酚羥基，能與自由基反應(yīng)，形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。共振半醌式自由基的穩(wěn)定性越大，黃酮類化合物的抗氧活性越強(qiáng)。黑果枸杞葉總黃酮抗脂質(zhì)體過氧化的機(jī)理可能與Gulcin等[13]的報道的相一致。其抗脂質(zhì)體過氧化機(jī)理主要分為兩部分，其一是通過供氫與氧化過程中產(chǎn)生的氧自由基(ROS)結(jié)合，終止脂質(zhì)體過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到抑制氧化的作用。其二是與Fe2+的螯合。金屬離子Fe2+、Cu2+等是脂質(zhì)體過氧化的重要促進(jìn)劑，其主要作用是促進(jìn)過氧化脂(ROOH)和脂分子(RH)的分解和氧分子活化產(chǎn)生自由基，從而生成多種可以進(jìn)入脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促進(jìn)反應(yīng)發(fā)生。黑果枸杞葉總黃酮之所以能抑制脂質(zhì)體過氧化反應(yīng)，可能是因為它們提供活潑氫與脂肪酸自由基相結(jié)合或與Fe2+螯合，使之轉(zhuǎn)化為惰性化合物，自身形成較穩(wěn)定的自由基，從而終止自由基連鎖反應(yīng)。如果脂質(zhì)過氧化被抑制，組成細(xì)胞膜脂質(zhì)當(dāng)然也免受氧化損傷，從而保護(hù)紅細(xì)胞避免發(fā)生溶血現(xiàn)象，同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成量就相應(yīng)減少。

不同黃酮成分其活性有別，實驗結(jié)果說明黑果枸杞葉總黃酮在生物體外具有抗氧化活性，為其在生物體內(nèi)實驗奠定了實驗基礎(chǔ)。同時也說明其中具有抗氧化成分，為其作為抗氧化藥物、保健品或食品抗氧化劑提供了參考。

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in vitroAntioxidant and Free Radical Scavenging Activities of Total Flavonoids from the Leaves ofLycium ruthenicumMurr.

LI Jin，LI Shu-zhen，F(xiàn)ENG Wen-juan，YUAN Hui
(Key Laboratory of Rare and Endangered Species Conservation Biology in Xinjiang, College of Life Science and Chemistry, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China )

In this study, the total flavonoid extract from the leaves ofLycium ruthenicumMurr. was tested for its reducing power, hydroxyl free radical scavenging activity, inhibitory effects on H2O2-induced hemolysis of mouse erythrocytes and on the generation of MDA, one of the end products of lipid peroxidation in hepatic tissue of mice in an effort to assess itsin vitroantioxidant and free radical scavenging activities. The results indicated that the extract could significantly inhibit hemolysis of mouse erythrocytes with an IC50 of 0.124 mg/mL, enhance the tolerance to reactive oxygen species in mouse serum, and reduce MDA generation in hepatic tissue of mice in a dose-dependent manner. Hence, the extract is a promising free radical scavenger and antioxidant.

Lycium ruthenicumMurr；total flavonoids；antioxidant activity；in vitro

R285.5

A

1002-6630(2010)13-0259-04

2009-11-23

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目(200991240)；新疆師范大學(xué)重點實驗室重大招標(biāo)課題(ZXBW08-4)

李進(jìn)(1969—)，男，副教授，博士，主要從事資源植物化學(xué)研究。E-mail：xjcjlj4@yahoo.com.cn