膜技術(shù)分離金銀花綠原酸提取液工藝研究

范遠(yuǎn)景，馬凌云，徐曉偉，張 平，方桐輝，胡曉薇

(1. 合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省祁門黃山藥谷科技有限公司，安徽 祁門 245600)

膜技術(shù)分離金銀花綠原酸提取液工藝研究

范遠(yuǎn)景1，馬凌云1，徐曉偉1，張 平2，方桐輝2，胡曉薇2

(1. 合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省祁門黃山藥谷科技有限公司，安徽 祁門 245600)

研究膜技術(shù)分離純化綠原酸提取液的過程。以金銀花為原料，以平均通量、膜截留率、綠原酸透過率為指標(biāo)，比較3種微濾膜MF1、MF2和MF3，4種超濾膜UF1、UF2、UF3和UF4，及兩種反滲透膜RO1和RO2對綠原酸提取液的過濾特性，并研究濃縮液的洗濾對綠原酸截留率的影響。結(jié)果表明：MF1、UF1和RO2膜的過濾性能明顯優(yōu)于其他同類型膜，使用MF1-UF1-RO2膜組合處理效果最佳，其綠原酸回收率可達67.75%，產(chǎn)品純度可達13.21%以上；同時，洗濾可進一步提高處理效果，經(jīng)間歇洗濾后，MF1膜的綠原酸截留率可由9.54%降低到1.17%，UF2膜的綠原酸截留率可由32.36%降低到20.11%。

金銀花；綠原酸；膜技術(shù)；超濾

金銀花(Lonicera japonicaThunb)為我國傳統(tǒng)中藥材，是重要的藥食兩用植物原料[1-3]。綠原酸(chlorogenic acid，CA)是金銀花的主要藥用成分，具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化、抑制突變、抗腫瘤、保護心血管、保肝利膽、抗菌、抗病毒等作用[4-9]，因而應(yīng)用極為廣泛。目前提取和純化綠原酸方法有水提醇沉法、醇提鉛鹽沉淀法、聚酰胺柱層析法、酶法等多種，但這些方法存在提取率低、對綠原酸的破壞大、處理量小、工藝過程長、產(chǎn)品純度低、衛(wèi)生安全性差和成本高的缺點。與此相比，膜分離技術(shù)作為一種新型高效、精密的分離技術(shù)，因其高效分離、設(shè)備簡單、節(jié)能、常溫操作、無污染等優(yōu)點而得到越來越廣泛的應(yīng)用[10-17]。因此在深入分析金銀花提取液的成分種類、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和膜技術(shù)特點的基礎(chǔ)上，本實驗對使用微濾分離固體微粒、用超濾除去大分子物質(zhì)、用反滲透濃縮的膜技術(shù)工藝處理綠原酸提取液以達到分離純化和濃縮綠原酸提取液目的的處理工藝進行研究，以期得到更可行的綠原酸工業(yè)生產(chǎn)的方案，擬為后期制備中、高純度綠原酸創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花 安徽省祁門“黃山藥谷”有限生物科技有限公司。

微濾膜為聚偏氟乙烯膜，超濾膜為聚砜膜，反滲透膜為醋酸纖維素酯膜。

氫氧化鈉(分析純)、無水乙醇(分析純)、冰醋酸(一級色譜純) 上海中試化工總公司；甲醇(一級色譜純)天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；綠原酸對照品(純度≥95%) Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FC104型電子天平 上海精科有限公司； H-H-4數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏華儀器廠；LC982型高效液相色譜儀 北京溫分分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司；YHG-9202-2型紅外干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；試驗型微濾膜分離設(shè)備(含多種膜組件) 合肥風(fēng)云膜分離技術(shù)有限公司；試驗型多功能膜分離設(shè)備(含多種膜組件) 合肥世杰膜工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

金銀花→粉碎過40目篩→水浸提→綠原酸水提液→冷沉24h后過濾→微濾→超濾→反滲透濃縮

水浸提條件：料液比1:20(m/V)，90℃提取45min，浸提3次；冷沉條件：室溫，24h；微濾、超濾均經(jīng)間歇水洗，每次10kg，重復(fù)3次。

1.3.2 綠原酸提取液的制備

取金銀花適量，40℃干燥至質(zhì)量恒定后粉碎過40目篩，按1:20(m/V)料液比加水浸泡1h后在90℃恒溫浸提45min，重復(fù)3次，合并提取液，冷沉24h后過200目篩，即得。

1.3.3 綠原酸提取液的微濾處理

取綠原酸提取液適量，分別選用MF1、MF2和MF3膜對其進行微濾處理，以除去不溶性固體顆粒及少量大分子物質(zhì)。在該階段實驗中，分別精確測量或測定MF1、MF2和MF3膜處理后的截留液、透過液的體積、瞬時膜通量、固形物含量和綠原酸含量，計算MF1、MF2和MF3膜的平均通量、膜截留率、CA透過率，根據(jù)以上工藝指標(biāo)選擇合適的微濾膜。

1.3.4 微濾透液的超濾

經(jīng)MF1膜微濾處理后的綠原酸透過液，分別選用UF1、UF2、UF3和UF4對其進行膜處理，以去除如蛋白質(zhì)、多糖(淀粉、纖維素等)、鞣質(zhì)或其復(fù)合物等大分子物質(zhì)及膠體物質(zhì)。在該階段實驗中，同樣分別精確測量、測定并計算UF1、UF2、UF3和UF4處理后的截留液、透過液的上述工藝指標(biāo)，根據(jù)以上指標(biāo)選擇合適的超濾膜。

1.3.5 超濾透過液的反滲透濃縮

經(jīng)超濾處理后的綠原酸透過液，分別選用RO1和RO2反滲透膜對其進行濃縮處理，以濃縮料液及除去少量小分子物質(zhì)。在該實驗中，根據(jù)其平均通量大小及有無綠原酸滲漏的工藝指標(biāo)選擇適當(dāng)?shù)姆礉B透膜。

1.3.6 最適膜組合的選擇

分別選取MF1-UF1-RO2、MF1-UF4-RO2、MF3-UF4-RO2、MF2-UF2-RO2膜組合對綠原酸提取液進行處理，考察并比較各個膜組合處理所得濃縮液中的CA純度(干物質(zhì))、CA收率和各個膜組合的總截留率(截留相對分子質(zhì)量：MF1＞MF2＞MF3＞UF1＞UF2＞UF3＞UF4＞RO1＞RO2)。

1.3.7 洗濾對膜處理效果的影響

分別取綠原酸提取液原液和經(jīng)MF1膜處理后的綠原酸透液各2份，分別用MF1和UF1膜進行膜處理。對其中一個微濾過程和一個超濾過程進行間歇洗濾，即將膜截留液以原液1/2體積純水進行洗濾(每次添加10L)，其余不洗濾，分別測量并計算各個膜處理過程的膜截留率、CA截留率、CA純度和CA收率等工藝指標(biāo)，考察其變化。

1.4 測定與分析方法

1.4.1 瞬時膜通量的測定

在膜處理過程中，使用量筒接取10s左右的透過液，準(zhǔn)確讀取其體積，記錄所用時間，結(jié)合所使用的膜的膜面積，計算瞬時膜通量。平均膜通量為瞬時膜通量的算術(shù)平均值。

1.4.2 膜截留率、綠原酸透過率和綠原酸截留率的測定

在膜分離過程中，分別精確測量相應(yīng)的原液、截留液和透過液的體積，并測定其綠原酸含量、固形物含量，分別計算相應(yīng)膜截留率、綠原酸透過率和綠原酸截留率。

CA截留率(A)=1－CA透過率

CA純度/%=綠原酸的質(zhì)量濃度/總固形物×100

CA收率/%=反滲透截留液中綠原酸總量/膜處理前原提取液中綠原酸總量×100

式中：R1為膜截留率；R2為綠原酸透過率；A為綠原酸截留率；w0為該膜處理過程起始液固形物含量/(g/L)；w1為截留液固形物含量/(g/L)；v0為該膜處理過程起始液體積/L；V1為截留液體積/L；V2為透過液的體積/L；c0為膜處理過程起始液綠原酸質(zhì)量濃度/(mg/L)；c2為透過液中綠原酸質(zhì)量濃度/(mg/L)。

1.4.3 HPLC法測定綠原酸含量

1.4.3.1 色譜條件

LC98Ⅱ型高效液相色譜儀，Kromasil ODS C1815μm色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱溫：30℃；流動相：甲醇-水(40:60，V/V)(含1%冰醋酸)；流速：0.3mL/min；檢測波長：327nm，進樣量20μL。

1.4.3.2 綠原酸含量測定

以標(biāo)品配制的不同濃度的對照品進樣，以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，以所得峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。處理數(shù)據(jù)得回歸方程為y=98667969.43x－142638.23，RSD=0.997%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸含量。

1.4.4 固形物含量測定

將膜分離過程中各階段的物料各精確取樣，置干燥箱中，105℃恒溫干燥至質(zhì)量恒定，測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 微濾膜的選擇

由于金銀花在水浸提過程中長時間受熱，其組織結(jié)構(gòu)已部分解體，所以綠原酸提取液中含有少量固體微粒和大量大分子物質(zhì)，難以除去。微孔過濾是除去不溶性固體微粒和大分子物質(zhì)的有效方法，但微濾膜截留相對分子質(zhì)量不同，微濾膜的通量、膜截留率和對綠原酸透過率可能會有很大的不同。微濾膜MF1、MF2 、MF3處理綠原酸提取液的情況見表1。由表1可知，三道微濾膜的膜截留率較為接近、差別不大，但MF1膜的平均通量和綠原酸透過率卻均高于MF2和MF3膜。這是因為MF1膜的截留相對分子質(zhì)量較大，膜孔較大，不易導(dǎo)致濃差級化，對綠原酸透過率影響較小的緣故。所以微濾過程應(yīng)選用MF1膜。

表1 3種微濾膜處理效果比較Table 1 Comparison of applications of three microfiltration membranes

2.2 超濾膜的選擇

由于微濾透液中仍含有大量大分子物質(zhì)及膠體物質(zhì)、綠原酸純度較低，所以應(yīng)繼續(xù)純化。超濾是除去提取液中的大分子物質(zhì)及膠體物質(zhì)，使溶液澄清化的好方法。但超濾膜截留相對分子質(zhì)量的不同，超濾的通量和過程的有效性會有差異，超濾膜UF1、UF2、UF3和UF4處理MF1微濾透過液的效果見表2。由表2可知，UF1膜的平均通量和綠原酸透過率均高于其他膜，但膜截留率則相對較低?？赡苁且驗殡s質(zhì)在UF2、UF3、UF4膜截留相對分子質(zhì)量附近分布較為集中，從而更容易導(dǎo)致濃差極化，進而影響平均通量、膜截留率和綠原酸透過率；同時UF1膜截留相對分子質(zhì)量較大、膜孔徑較大的緣故。故超濾實驗選用UF1膜為宜。

表2 4種超濾膜處理效果比較Table 2 Comparison of applications of four ultrafiltration membranes

2.3 反滲透膜的選擇

反滲透可以脫除提取液中的水分，從而達到濃縮提取液富集綠原酸的目的。反滲透膜的截留相對分子質(zhì)量大小不同對反滲透過程的膜通量和綠原酸的截留率會產(chǎn)生不同的影響。由于目標(biāo)物質(zhì)綠原酸的相對分子質(zhì)量也較小，所以在反滲透膜處理的過程中可能會有泄露，應(yīng)予避免。RO1和RO2反滲透膜處理超濾透液的情況見表3。由表3可知，RO1和RO2兩道反滲透膜的膜截留率和平均通量均十分接近，但RO1膜有綠原酸滲漏情況發(fā)生(通過透過液監(jiān)控檢測)，這是因為RO1膜的截留相對分子質(zhì)量和膜孔徑相對較大的緣故。所以反滲透實驗選用RO2膜為宜。

表3 RO1、RO2膜處理效果比較Table 3 Comparison of applications of two reverse osmosis membranes

2.4 膜處理工藝的選擇

上述實驗表明，選用MF1-UF1-RO2的膜組合過濾，其綠原酸純度和綠原酸收率均明顯優(yōu)于其他膜組合。使用MF1-UF1-RO2的膜組合過濾，綠原收率為67.75%，綠原酸純度為13.21%，膜總截留率為39.25%。所以金銀花綠原酸提取液的分離純化應(yīng)選用MF1-UF1-RO2膜組合。

2.5 洗濾對膜處理效果的影響

在膜分離過程中，當(dāng)截留液體積小到不足以形成回流時，膜分離過程就不能進行。但此時濃縮液中還含有較高濃度的綠原酸，為了充分利用原料，采用截留液加純水稀釋以形成膜回流的工藝是必要的。間歇加入1/2濃縮液體積的純水進行洗濾前后，MF1和UF1膜的綠原酸截留率見表4。由表4數(shù)據(jù)可知，微濾、超濾的截留液經(jīng)過間歇洗濾后，膜對綠原酸的截留率均明顯降低了，尤其是微濾膜MF1的截留液經(jīng)間歇洗濾后其綠原酸截留率大幅度降低，由未洗濾前的9.54%降至1.17%。

表4 洗濾前后膜截留率和綠原酸截留率Table 4 Effect of diafiltration on MF1 and UF2 separations

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，在同類型膜中MF1膜、UF1膜和RO2膜效果較好；使用MF1-UF1-RO2膜組合完全可以達到大規(guī)模初步分離綠原酸的目的，且效果較佳，其綠原酸收率可達67.75%，產(chǎn)品純度可達13.21%。同時，結(jié)合洗濾可進一步提高處理效果。但反滲透濃縮液中的綠原酸含量雖然很高，其中卻存在大量的與綠原酸結(jié)構(gòu)相似、相對分子量相近、性質(zhì)也近似的黃酮、酚酸等類物質(zhì)，會影響產(chǎn)品CA純度含量等問題將進一步實驗研究。綜上所述，在膜技術(shù)分離浸提原液的基礎(chǔ)上，在制品將進行柱層析分離技術(shù)進一步純化獲得中、高含量綠原酸產(chǎn)品是實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)、滿足市場不同綠原酸純度產(chǎn)品要求的可行思路。

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Application of Membrane Separation for the Purification of Chlorogenic Acid-rich Extract fromLonicera japonicaThunb.

FAN Yuan-jing1，MA Ling-yun1，XU Xiao-wei1， ZHANG Ping2，F(xiàn)ANG Tong-hui2，HU Xiao-wei2
(1. College of Biotechnology and Food Engineeing, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；
2. Anhui Huangshan Herb Valley Bio-Technology Co. Ltd., Qimen 245600, China)

In terms of average membrane permeation flux, membrane retention rate and permeation rate of chlorogenic acid, the applications of three microfiltration membranes (MF1, MF2 and MF3), four ultrafiltration membranes (UF1, UF2, UF3 and UF4) and two reverse osmosis membranes (RO1 and RO2) for the purification of the chlorogenic acid-rich extract fromLonicera japonicaThunb were evaluated. MF1, UF1 and RO2 were found to be even better than other similar membranes. Optimal purification was achieved by the sequential combined use of MF1, UF1 and RO2, and the maximum chlorogenic acid recovery was up to 67.75%, and a product with a purity exceeding 13.21% was obtained. Additionally, diafiltration could improve the treatment effect, and the retention rate of chlorogenic acid was decreased from 9.54% to 1.17% in MF1 separation and from 32.36%to 20.11% in UF2 separation after intermittent diafiltration.

Lonicera japonicaThunb；chlorogenic acid；membrane technology；ultrafiltration

TS201.1

A

1002-6630(2010)20-0043-04

2010-02-06

黃山市重點科技項目(2009ZN-09)

范遠(yuǎn)景(1958—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：swf89105@mail.hf.ah.cn