副溶血弧菌tdh基因在畢赤酵母中的表達(dá)及溶血活性檢測(cè)

趙永剛, 戰(zhàn)文斌, 薩仁高娃, 王君瑋, 王志亮

(1．中國(guó)海洋大學(xué)教育部 海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2．中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心, 山東青島 266032; 3．中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

副溶血弧菌tdh基因在畢赤酵母中的表達(dá)及溶血活性檢測(cè)

趙永剛1,2, 戰(zhàn)文斌1, 薩仁高娃3, 王君瑋2, 王志亮2

(1．中國(guó)海洋大學(xué)教育部 海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2．中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心, 山東青島 266032; 3．中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071)

通過PCR技術(shù)從副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, VP)基因組DNA上擴(kuò)增耐熱溶血素基因tdh, 雙酶切后定向插入到酵母表達(dá)載體 pPICZaA中, 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pPICZaA-tdh, 經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)GS115, 經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定耐熱溶血素基因成功整合到畢赤酵母的基因組中。在甲醇誘導(dǎo)下進(jìn)行 tdh 的表達(dá), SDS-PAGE分析證明重組 TDH(thermostable direct hemolysin, TDH) 的分子質(zhì)量約為23 ku, 經(jīng) Western blotting 鑒定VP抗體能與表達(dá)的 TDH 發(fā)生特異反應(yīng), 說明 tdh 基因在畢赤酵母中的表達(dá)是準(zhǔn)確的。溶血實(shí)驗(yàn)證明了表達(dá)的TDH 具有溶血活性。本研究首次應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)耐熱溶血素基因 tdh, 在培養(yǎng)基中獲得分泌表達(dá)的耐熱溶血素, 為研究tdh基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

耐熱溶血素; 分泌表達(dá); 畢赤酵母; 溶血活性

VP 是中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)的病原菌, 引起對(duì)蝦紅腿病; 該菌也能感染養(yǎng)殖蟹類與貝類, 導(dǎo)致養(yǎng)殖蟹類及貝類的大量死亡; 此外, VP對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(Pseudosciaena crocea), 的致病性己有較多的報(bào)道, 主要引起體表充血及腸炎的癥狀,在高溫季節(jié)造成大量的死亡; 因此, 該菌是養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物的重要條件性病原。具有致病性的菌株還能導(dǎo)致： (1) 食物中毒： 尤以日本、東南亞、美國(guó)等國(guó)家多見, 也是我國(guó)沿海地區(qū)及臺(tái)灣省食物中毒最常見的一種病原菌; (2) 急性腹瀉?。?是發(fā)展中國(guó)家急性腹瀉病的主要病原體之一, 占分離菌株的 20%以上[1]; (3) 旅游者腹瀉： 日本學(xué)者在 Osaka和 Kansai飛機(jī)場(chǎng)衛(wèi)生檢疫站從出國(guó)旅游的36 780 440名旅客中共發(fā)現(xiàn)84 777名腹瀉患者, 其中由副溶血性弧菌所致者為1 959人[2]; (4)其他： 如反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(該菌能產(chǎn)生 HSP60)[3]和心臟疾病等[4]。目前研究認(rèn)為副溶血性弧菌的致病因子包括細(xì)菌產(chǎn)生的毒素(溶血素、尿素酶)和侵襲因子[5]。迄今已發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌主要有三種類型的溶血素, 即耐熱的TDH和兩種不耐熱的 TRH(TDH related hemolysin, TRH),TLH(thermolabile hermolysin．TLH)[6]。但是, 對(duì)其致瀉和溶血的機(jī)制、毒素的功能結(jié)構(gòu)域等尚不十分清楚。為研究 VP 溶血毒素的功能結(jié)構(gòu)域、闡明其致病機(jī)理, 本研究從實(shí)驗(yàn)室保存的 VP 臨床分離株的基因組 DNA 中擴(kuò)增出 tdh 基因, 并實(shí)現(xiàn)其在酵母表達(dá)系統(tǒng)中的高效、可溶性、分泌型表達(dá), 獲得了高效表達(dá)抗原, 并對(duì)其溶血活性進(jìn)行了初步研究,并為制備抗TDH的多克隆抗體或單克隆抗體及基因功能的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, VP)、大腸桿菌(Escherichia coli) JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存, EasySelect Pichia Expression Kit 購自Invitrogen 公司。

1.2 試劑與工程酶

Ex Taq聚合酶、pMD18-T 試劑盒、DNA Marker DL2000、DL15000、限制性內(nèi)切酶Xho I、Xba I、Sac I, DNA回收試劑盒、T4DNA連接酶均購自大連寶生物工程公司; SDS、丙烯酰胺、叉丙烯酰胺、TEMED 等購自 BBI 公司; 其他試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LLB、YPD、MDH、MMH、BMGY、BMMY培養(yǎng)基的組成和配制參見 Invitrogen 公司畢赤酵母(Pichia pastoris,P. pastoris)表達(dá)試劑盒操作手冊(cè)。

1.4 PCR擴(kuò)增目的基因

[12]將“多”誤用為“少”，是將目的語過度的泛化，“多”“少”混用；[13]是目的語知識(shí)的負(fù)遷移，“越來越”與“消失”都表示逐漸減少，不能同時(shí)使用；[14]是母語的負(fù)遷移，“不多”與“少”在外語中可以用相同形式表示，漢語中是兩個(gè)不同的詞語。

根據(jù)對(duì)酵母表達(dá)載體 pPICZaA 的限制性酶切位點(diǎn)分析, 并參考副溶血弧菌tdh基因序列(GenBank

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物Tab. 1 Primers used in this study

以VP基因組DNA為模板, 通過PCR擴(kuò)增得到直接耐熱溶血素tdh基因片段。PCR反應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性5 min, 94℃變性45 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

回收 PCR 產(chǎn)物, 用XhoI 和XbaI 對(duì)回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pPICZaA 分別進(jìn)行雙酶切?；厥蛰d體和目的基因, 用 T4DNA 連接酶在 16℃ 下連接,構(gòu)建表達(dá)載體pPICZaA-tdh, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109, 用 LLB 瓊脂平板(含 Zeocin 25mg/L)篩選。選擇陽性克隆, 提取質(zhì)粒DNA, 用XhoI 和XbaI 雙酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.6 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

用SacI 限制性內(nèi)切酶將重組質(zhì)粒pPICZαA-tdh線性化, 膠回收酶切產(chǎn)物。制備畢赤酵母 GS115 感受態(tài)細(xì)胞, 通過電轉(zhuǎn)化法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母 GS115中。酵母轉(zhuǎn)化株經(jīng) YPD (含 Zeocin 25mg/L)液體培養(yǎng)后提取酵母基因組 DNA, 用 PCR方法鑒定目的基因與染色體整合的情況。

1.7 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選得到的重組酵母 GS115/pPICZaA-tdh接種于含25 mLBMGY 培養(yǎng)基的三角瓶中, 28～30℃、300 r/min培養(yǎng) 16～18 h, 當(dāng)光吸收值A(chǔ)600達(dá)到2.0～6.0。室溫下3 000g離心5 min, 收集菌體, 用約200 mL BMMY重懸菌體, 使A600為1.0左右。將菌液置于 1 L的搖瓶中, 用雙層紗布或粗棉布封口,放置于28～30℃、300 r/min的搖床上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每12 h 取菌液1 mL并向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至M 10069), 在基因上下游設(shè)計(jì)特異引物tdhR 和tdhS,序列見表1, 由大連寶生物工程有限公司合成。下劃線部分分別是XhoI 和XbaI 酶切位點(diǎn), 上游引物中AAAAGA為 pPICZα 系列載體 α 分泌因子的KEX 2 切割位點(diǎn)。終濃度為0.5%, 取的菌液12 000g離心10 min, 分離的上清和菌體分別進(jìn)行SDS-PAGE(12%)分析。

1.8 兔抗VP血清的制備

在無菌條件下取培養(yǎng)過夜的 VP, 接種于含 5%血清的LB平板培養(yǎng)基上, 放置37℃ 孵育24 h; 挑取單菌落接種于含5% 血清5 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃ 劇烈振蕩 12～16 h; 然后按 1： 1 000轉(zhuǎn)接于1 000 mL含5%血清LB液體培養(yǎng)基中37℃ 搖12～16 h, 5000 r/min收集菌體; 置于100 mL滅菌生理鹽水的三角燒瓶中, 搖動(dòng)混勻菌體; 用滅菌生理鹽水配制成 6×1010/mL(通過活菌計(jì)數(shù)法)的菌懸液, 用終濃度為0.5% 的甲醛滅活48 h; 5000 r/min離心10 min,收集菌體; 用滅菌生理鹽水洗滌1次, 5 000 r/min離心, 棄上清, 無菌試驗(yàn)合格后, 4℃ 12 000 r/min離心棄上清。

采用腹腔注射法免疫新西蘭大白兔, 免疫程序?yàn)榈?1、第 5、第9、第 11和第 13天, 注射劑量分別為 12×1010、12×1010、18×1010、18×1010和 18×1010個(gè), 末次免疫后第7天從耳緣靜脈取少量血液, 室溫靜置30 min后, 4℃以3000 r/min離心5 min, 取血清置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定

將表達(dá)的TDH進(jìn)行SDS-PAGE電泳, SDS-PAGE電泳后的蛋白膠通過半干轉(zhuǎn)印方法, 將膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上, 利用Western blotting方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物的特異性, Western blotting所用的一抗為上述制備的的VP抗體, 二抗為anti-rabbit IgG(Fab)- HRP。

1.10 表達(dá)蛋白溶血性檢測(cè)

將重組酵母培養(yǎng)液以 3 000 r/min 離心 5 min,取上清液加入終濃度為5 mmol/L的DTT室溫作用30 min; 然后在兔血平板上打兩個(gè)孔, 分別加入 50μLDTT作用的蛋白及5 mmol/L的DTT, 37℃ 培養(yǎng)12～24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增目的基因

以VP基因組 DNA 為模板, 經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到576 bp 左右的片段, PCR 產(chǎn)物回收電泳結(jié)果見圖1。

圖1 tdh基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification products of tdh gene1. DL2000 Marker; 2. tdh PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1. DL2000 Marker; 2. tdh PCR products

2.2 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

將膠回收的 PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體 pPICZaA經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切, 連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒, 質(zhì)粒經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切鑒定后出現(xiàn)2條帶, 一條帶為載體約 3 600 bp, 另一條帶約為 576 bp, 電泳結(jié)果如圖2所示。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明該質(zhì)粒中含有目的基因片段, 且讀碼框正確, 獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-tdh。用SacI 對(duì)重組質(zhì)粒 pPICZaA-tdh進(jìn)行線性化后, 電轉(zhuǎn)化宿主菌 GS115, 利用酵母表達(dá)載體通用引物 5′AOX1、3′AOX1 和目的基因特異性引物 tdhR、tdhS對(duì)重組子進(jìn)行PCR鑒定。從圖2可以看出, 使用表達(dá)載體通用引物, 陽性重組菌擴(kuò)增出1 100 bp 左右的片段,使用基因特異性引物, 擴(kuò)增出576 bp 左右的片段。電泳結(jié)果顯示條帶大小與理論值相符, 證明線性化的 pPICZaA-tdh 與酵母菌 GS115 染色體基因組成功重組。

2.3 重組蛋白在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)

重組畢赤酵母 GS115/pPICZaA-tdh的誘導(dǎo), 每12 h 取菌液1 mL并向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%, 取的菌液12 000g離心10 min, 分離的上清和菌體分別進(jìn)行SDS-PAGE(12%)分析。結(jié)果在96 h出現(xiàn)表達(dá)條帶, SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖 3所示, 從圖中可以看出, 在分子質(zhì)量 23 ku 處有明顯的特異條帶。

圖2 陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定和重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-tdh酶切鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification of transformants by PCR and pPICZaA-tdh after digestion by Xho I and Xba I1. 通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物; 2. 特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物; 3. DNA marker DL2000; 4. pPICZaA-tdh雙酶切結(jié)果; 5. DNA marker DL2000;6. DNA marker DL150001. DNA marker DL2000; 2. PCR products with universal primers;3. PCR products with specific primers;4. pPICZaA-tdh after digestion by Xho I and Xba I;5. DNA marker DL2000; 6. DNA marker DL15000

2.4 表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定

將表達(dá)的 TDH與上述制備的 VP抗體進(jìn)行Western blotting分析, 結(jié)果制備的VP抗體能與表達(dá)的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng), 如圖 3 所示, 表明表達(dá)的蛋白是正確的。

2.5 溶血活性檢測(cè)

將50μL DTT作用后的蛋白和5 mmol/L DTT分別加入兔血平板, 37℃培養(yǎng)2～3 h后, 可見與 DTT作用后的蛋白周圍出現(xiàn)溶血現(xiàn)象, 而5 mmol/L DTT對(duì)照孔周圍無溶血現(xiàn)象, 如圖4所示。

3 討論

與大腸桿菌相比, 酵母是低等真核生物, 具有細(xì)胞生長(zhǎng)快, 易于培養(yǎng), 遺傳操作簡(jiǎn)單等原核生物的特點(diǎn), 又具有真核生物對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工, 修飾, 合理的空間折疊等功能, 非常有利于真核基因的表達(dá), 因此酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來越多的重視和利用, 其中畢赤酵母(P. pastoris)因具備良好的發(fā)酵與分泌性能, 尤引人注目[7～9]。目前利用P. pastoris已成功地表達(dá)了多種極有價(jià)值的蛋白, 如破傷風(fēng)毒素的C 片段[10]、HIV gp120[11]及乙型腦炎病毒E 蛋白[12]、家蠶抗菌肽及HPV 16E6 蛋白[13,14]等, 在基因工程疫苗的開發(fā)研制中已顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。

圖3 重組蛋白在畢赤酵母中表達(dá)和Western blotting分析Fig. 3 SDS-PAGE and Western blotting analysis of recombinant TDH protein in P. pastoris1. 經(jīng)過5天培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pPICZαA GS115細(xì)胞; 2.4. 經(jīng)過5天培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染了pPICZaA-tdh GS115細(xì)胞培養(yǎng)上清; 3. 經(jīng)過5天培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染了 pPICZaA-tdh GS115細(xì)胞; 5. 表達(dá)蛋白的Western blotting鑒定. M. 低分子質(zhì)量蛋白Marker1. P. pastoris GS115 cells transformed with plasmid pPICZαA after five days of cultivation; 2, 4 cells culture supernatants after five days of cultivation of P. pastoris GS115 cells transformed with expression plasmid pPICZaA-tdh; 3. P. pastoris GS115 cells transformed with plasmid pPICZaA-tdh after five days of cultivation;5. Western blotting analysis of recombinant TDH protein; M. a low molecular mass SDS calibration standard

圖4 TDH的溶血活性檢測(cè)Fig. 4 Hemolysis by TDH1.TDH; 2. 5 mmol/L DTT1. TDH; 2. 5 mmol/L DTT

Vp的TDH是一種腸毒素, 是Vp的主要致病因子, 能引起小腸絨毛刷狀緣脫落。對(duì)腸道毒素源性微生物而言, 抗毒素的免疫應(yīng)答起著非常重要的免疫保護(hù)作用[15～19], 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人們對(duì)各種類型疫苗優(yōu)劣比較的進(jìn)一步深化, 應(yīng)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建基因工程疫苗已成為大勢(shì)所趨。

本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室保存的VP臨床分離株的基因組 DNA中成功地?cái)U(kuò)增出tdh基因;經(jīng)序列測(cè)定和比對(duì), 這個(gè)基因的核苷酸序列與Genbank上已發(fā)表的序列的同源性為99.9%, 因此可以確定副溶血弧菌的基因組含有這個(gè)基因, 并成功將tdh基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體 pPICZaA 上,構(gòu)建了重組表達(dá)載體; 經(jīng)甲醇誘導(dǎo), SDS-PAGE電泳證明了tdh基因發(fā)生了表達(dá), 表達(dá)產(chǎn)物約為 23 ku,與推測(cè)的理論產(chǎn)物大小一致。本研究在畢赤酵母中成功表達(dá)了編碼 TDH 的基因在國(guó)內(nèi)外尚屬首次,經(jīng)溶血活性檢測(cè)表達(dá)蛋白具有溶血活性, 為制備抗TDH的多克隆抗體或單克隆抗體及基因功能和致病性的研究打下基礎(chǔ)。

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Expressing the tdh gene of Vibrio parahaemolyticus in Pichia pastoris and its hemolysis activity

ZHAO Yong-gang1,2, ZHAN Wen-bin1, SAREN Gao-wa3, WANG Jun-wei2, WANG Zhi-liang2

(1. Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;2. China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China; 3. Key Laboratory of Marine Geology and Environment, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Apr., 22, 2010

Thenmostable direct hemolysin; Secretory expression; Pichia pastoris; Hemolysis

We cloned thenmostable direct hemolysin gene (tdh) from the genome DNA of Vibrio parahaemolyticus polymerase chain reaction (PCR). The gene was ligated into eukaryotic expression vector pPICZaA. The recombinant plasmids pPICZaA-tdh was transformed into P. pastoris GS115 cells by electroporation after SacI digestion.After the transformed cell was induced with methanol, one protein of 23 kDa appeared in the medium as detected by SDS PAGE. Western blotting showed that recombinant TDH would react with rabbit antiserum immunitied by VP antigen. The recombinant protein also showed hemolytic activity. This is the first report describing successful expression of the tdh gene in P. pastoris and consequent production of secretory recombinant TDH, providing a framework for further structural and functional studies.

P714+.5

A

1000-3096(2010)09-0010-05

2010-04-22;

2010-06-25

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA100306; 2006AA100307)

趙永剛 (1974-), 男, 博士研究生, 主要從事水生生物學(xué)研究, 電話： 053287839922, E-mail： zhyg929@163.com; 戰(zhàn)文斌, 通信作者, 電話： 0532-82032284, E-mail： wbzhan@ouc.edu.cn

(本文編輯： 康亦兼)