日本鬼鲉不同組織的8種同工酶譜

董徐輝, 李明云

(寧波大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 浙江 寧波 315211)

日本鬼鲉不同組織的8種同工酶譜

董徐輝, 李明云

(寧波大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 浙江 寧波 315211)

采用垂直聚丙烯酰胺平板電泳技術(shù), 對象山港野生日本鬼鲉(Inimicus japonicus)的9種組織器官的8種同工酶進行研究, 并分析了其酶譜表型。結(jié)果表明,琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase, 簡稱SuDH)在所有組織中均存在, 組織間差異較小; 乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase, 簡稱LDH)、蘋果酸脫氫酶((Malate dehydrogenase, 簡稱MDH)、蘋果酸酶(Malic enzyme, 簡稱ME)、酯酶(Esterase, 簡稱EST)、醇脫氫酶(Alcoholdehydrogenase, 簡稱ADH)、過氧化物酶(Peroxidase, 簡稱POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, 簡稱SOD)則具有明顯的組織特異性, 且這些酶在表型、分布和活性上均表現(xiàn)出高度的組織特異性。

日本鬼鲉(Inimicus japonicus); 同工酶; 組織特異性表達

日本鬼鲉(Inimicus japonicus), 俗稱老虎魚, 海蝎子, 為暖溫性底層魚類。在中國產(chǎn)于南海、東海、黃海和渤海[1]。其頭長短于頭寬, 頭側(cè)和下頜下方有許多發(fā)達的皮須, 鰓蓋膜分離, 與峽部相連, 體無鱗,背鰭有 16～17鰭棘, 胸鰭下葉有兩指狀游離鰭條;其體色呈紅色或黃, 體長可達200 mm, 初夏產(chǎn)卵。背鰭鰭棘基部后面各有發(fā)達的毒腺, 被刺傷后腫痛甚劇烈, 故俗名“海蝎子”。目前, 有關(guān)日本鬼鲉的研究不多, 2003年 Nozaki等[2]對日本鬼鲉的生殖周期進行了研究;2003年Takushima等[3]對日本鬼鲉人工催產(chǎn)和人工受精進行研究, 并取得成功; 2005年劉振勇等[4]通過人工育苗獲得鬼 幼魚 11.025萬尾。此外, 劉曉萍等[5,6]對背鰭棘毒腺結(jié)構(gòu)進行光鏡和電鏡觀察。然而日本鬼鲉種質(zhì)方面的研究未見有人報道。鬼 作為一種經(jīng)濟水產(chǎn)動物, 在國內(nèi)已經(jīng)開展了人工育苗和養(yǎng)殖研究。因此, 對其進行種質(zhì)研究也是十分必要。

種質(zhì)資源是育種的物質(zhì)基礎(chǔ)。要育成好的魚類品種, 必須要有豐富的種質(zhì)資源, 大量收集、了解、保存、利用種質(zhì)資源是國內(nèi)外科研工作者十分重視的工作之一。同工酶技術(shù)可以從生化遺傳的角度, 了解某一物種的遺傳結(jié)構(gòu)及其多樣性, 且穩(wěn)定性較好,技術(shù)也已經(jīng)相當成熟。本研究對日本鬼鲉 9種組織中的 8種同工酶進行了檢測分析, 旨在為日本鬼鲉的種質(zhì)研究積累資料, 為進一步研究象山港野生日本鬼鲉的遺傳特性、種質(zhì)鑒別、生物進化等提供一定的理論依據(jù)[7]。

1 材料與方法

1.1 材料采集及樣品制備

實驗魚共 8尾采自浙江象山港, 均為野生雌性成魚,質(zhì)量平均約為0.45 kg±0.05 kg, 用丁香酚麻醉,立即解剖, 取肝臟、脾臟、心臟、腎臟、腦、鰓、眼睛、腸和肌肉等 9種組織。實驗時取上述9種組織稱質(zhì)量后, 以 1 ： 3的比例(W/V)加入0.05%巰基乙醇水溶液, 再加適量石英砂, 冰浴條件下研磨勻漿,4℃冷凍, 離心15 000 r/min, 離心30 min (肝臟離心2次或更多次, 直至提取的酶液純清), 取上清液, 按1 ： 1的比例加入40%甘油和0.1%溴酚藍指示劑后分裝, 立即用于電泳分析或放入-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 電泳、染色

采用不連續(xù)垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳法, 分離膠濃度為 8.2%(pH8.9), 濃縮膠濃度為 3.6%(pH6.7),電泳緩沖液為 TG(Tris-Gly), pH 8.3; 電泳的方法參照文獻[8], 略作修改。實驗時采用 DYY-2C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和DYCZ-24D型垂直電泳槽, 電泳在4 ℃冰箱中進行。TG系統(tǒng)穩(wěn)壓200V,電泳時間2～3 h。組織化學(xué)染色方法參照文獻[8,9]。染色后用 7.5%冰醋酸溶液固定, 掃描儀掃描、拍照, 手工記錄酶帶遷移率。

1.3 圖譜記錄

主要采用2種方法進行酶譜的記錄, 即： 按酶帶的遷移距離和染色深度, 在記錄本上記錄; 掃描成像并儲存于電腦中。

同工酶縮寫、編號、座位等的命名采用胡能書等[8]推薦的方法, 以各酶帶的相對遷移率(Rf)從大到小依次命名, 即從陽極向陰極運動的酶帶開始依次命名為1、2、3、…,Rf=l/L, l為陰極端至各酶帶中點的距離,L為陰極端至指示劑終點的距離。

2 結(jié)果

本實驗共檢測了LDH、MDH、SOD、ME、ADH、POD、EST和SuCD共8種同工酶。8種同工酶均檢測到有活性的酶帶。

2.1 乳酸脫氫酶(LDH E.C.1.1.1.27)

LDH除心、眼睛和腦組織外, 其他組織均只有一條酶帶A4; 眼睛有4條帶, 分別是A4、A2B2、AB3和 B4, 但是沒有檢測到 A3B1的存在; 心、腦表現(xiàn)為兩條酶帶, 分別是 A4、A3B1。C基因位點在本實驗中未檢測到。在酶活性上, 肌肉和心臟組織較強, 肌肉中最強(圖1)。

圖1 日本鬼鲉不同組織LDH圖譜Fig. 1 LDH patterns in various tissues of Inimicus japonicus1. 眼; 2. 鰓; 3. 腎; 4. 心; 5. 腦; 6. 肌肉; 7. 脾臟; 8. 肝臟; 9. 腸, 數(shù)字上“-”為原點(圖 2～圖 8 同)1. eye; 2. branchia; 3. kidney; 4. heart; 5. brain; 6. musle; 7. spleen; 8. liver; 9. intestine, “-”as origin(the same as Fig.2～Fig.8)

2.2 蘋果酸脫氫酶(MDH E.C.1.1.1.37)

硬骨魚類的MDH有上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)兩種, 均為兩個基因位點編碼的二聚體[10]。日本鬼鲉不同組織中的 MDH分別有 3～5條帶。MDH 1、MDH 2、MDH 3、MDH 4是上清液型,MDH 5、MDH 6是線粒體型。上清液型MDH 2、MDH 3、MDH 4在檢測的 9組織中都有分布, 而MDH 1是腎、肌肉、肝特有的。線粒體型 MDH 5在心和腦中有表達, 線粒體型 MDH6在鰓、腎、肌肉、腸中有表達(圖2)。

2.3 超氧化物歧化酶(SOD E.C.1.15.1.1)

超氧化物歧化酶分二聚體的 s-SOD(上清液型)和四聚體的 m-SOD(線粒體型) 兩類,有兩個基因位點編碼[11]。s-SOD是可溶性的,在上清液中酶含量較高, 易于檢測出來。作者檢測到 SOD1是 m-SOD,SOD 2和SOD 3是s-SOD。超氧化物歧化酶在日本鬼鲉各組織或器官中有明顯的差異表達, 在脾臟,腸中均有3條帶, 眼中有微弱的一條帶, 腦中沒有發(fā)現(xiàn)SOD表達, 其余的各組織中均有兩條帶(圖3)。

2.4 蘋果酸酶(ME E.C.1.1.1.40)

日本鬼鲉的ME檢測到2～5條酶帶。魚類的ME可分為細胞質(zhì)型(s-ME) 和線粒體型(m-ME) ,其中m-ME由1個基因位點編碼,為四聚體產(chǎn)物,在電泳圖譜上遷移較慢; s-ME 也是四聚體產(chǎn)物[12]。ME-5是m-ME, 其余都是s-ME。ME-2, ME-3, ME-4存在于所有器官組織中, ME-1存在心臟和脾臟中。ME-5在鰓、腎、心和肌肉中檢測到(圖4)。

2.5 醇脫氫酶(ADH E.C.1.1.1.1)

在以前的報道中, 魚類ADH被認為是由1個基因位點編碼或由兩個基因位點編碼的二聚體酶[13]。從日本鬼鲉的醇脫氫酶電泳圖來看, 醇脫氫酶應(yīng)該是3個基因位點編碼。在日本鬼鲉的肝臟中有非常特異的ADH-2,ADH-3兩條帶, 和其他組織有明顯的差異性。在日本鬼鲉的眼沒有檢測到醇脫氫酶的活性條帶(圖5)。

圖2 日本鬼鲉不同組織MDH圖譜Fig. 2 MDH patterns in various tissues of Inimicus japonicus

圖3 日本鬼鲉不同組織SOD圖譜Fig. 3 SOD patterns in various tissues of Inimicus japonicus

圖5 日本鬼鲉不同組織ADH圖譜Fig. 5 ADH patterns in various tissues of Inimicus japonicus

2.6 過氧化物酶(POD E.C.1.11.1.7)

從已有的研究結(jié)果來看,有的魚類 POD 被認為是二聚體酶,有的則認為是單體酶[14], POD在日本鬼鲉中可能是二聚體。POD表現(xiàn)出很強的組織特異性,在9個組織中除肌肉外, 都有相應(yīng)條帶表達。在日本鬼鲉的眼、鰓、腎、心、腦中各檢測到1個條帶, 脾、肝、腸檢測到9條酶帶且表達活性比其他組織強(圖6)。

圖6 日本鬼鲉不同組織POD圖譜Fig. 6 POD patterns in various tissues of Inimicus japonicus

2.7 酯酶(EST E.C.3.1.1.1)

酯酶為單體或二聚體, 從以上的圖譜來看日本鬼鲉的酯酶應(yīng)該是二聚體。EST的表型比較復(fù)雜, 從圖上共可以觀察到2～7條帶。日本鬼鲉的腎、腸, 肝臟和眼中酯酶活性較高, 其他組織中也有不同數(shù)目和深度酶帶的表達, 其中在腦中只有 EST-3的表達(圖 7)。

2.8 琥珀酸脫氫酶(SuCD, E.C.1.3.99.1)

日本鬼鲉 SuCD在各組織中表達較一致, 都為兩酶帶, 且遷移率相同, 在表達活性上也沒有顯著差異(圖 8)。

圖7 日本鬼鲉不同組織EST圖譜Fig. 7 EST patterns in various tissues of Inimicus japonicus

圖8 日本鬼鲉不同組織SuCD圖譜Fig. 8 SuCD patterns in various tissues of Inimicus japonicus

3 討論

所檢測的 8種酶是復(fù)雜酶系統(tǒng)其中之一, 它們以各種同工酶的不同形式來參與機體的代謝和調(diào)節(jié)。因為某一形式的同工酶在機體中都有著不同的作用, 因此不同組織中有著不同形式的同工酶, 協(xié)助各組織完成各自的代謝任務(wù)。

LDH與乳酸的產(chǎn)生和利用有關(guān)。當肌肉在劇烈運動時, 需要乳酸脫氫酶的參與下進行無氧運動從而使三羧酸循環(huán)受阻產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。此后在乳酸的利用也需要LDH的參與。肌肉中的無氧運動頻率要遠遠高于其他組織, 所以在日本鬼鲉肌肉中LDH的活性很強。LDH在魚類肌肉大量表達的情況與姜建國等[14]對青魚(Boleophthalmus pectinirostris)的 LDH圖譜研究結(jié)果相一致。Shaklee等[15]在硬骨魚類的LDH-AB3與- A2B2之間也曾觀察到1條酶帶 LDH-C4, 姜建國等[14]在青魚的 LDH圖譜中LDH-B4后面也有 LDH-C4條帶, 可是作者的實驗中沒有發(fā)現(xiàn) LDH-C4。LDH-C4可能是在某些硬骨魚類中才能存在, 因為黃福勇等[16], 王軍等[17]分別在香魚(Plecoglossus altivelis), 大黃魚(Pseudosiciaena crocea)中也沒有發(fā)現(xiàn) LDH-C4條帶。ADH也是參與糖酵解的重要酶類, ADH在肝臟中活性大且同工酶形式較多, 這與管丹東[18], 黃福勇[16], 李明云[19],尤峰等[20]的研究結(jié)果一致。ADH的活性不穩(wěn)定, 樣品在-70℃冰箱保存1個月后, 發(fā)現(xiàn)其活性明顯下降,圖譜上條帶會變得很弱, 甚至檢測不到。金春華等[21]對大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)的ADH研究中也發(fā)現(xiàn)其比較容易失活。所以, 在做ADH的研究中必須保持樣品新鮮度。

Starzyk等[22], 姜建國[14], 金春華等[21]對其他魚類的研究中上清液型MDH只有3條帶, 他們分別是由兩個基因編碼的MDH-A2, MDH-AB, MDH-B2。而日本鬼鲉上清液型MDH有4條, 這說明在日本鬼鲉上清液型MDH不只有兩個基因座位編碼, 而有3個基因座位編碼。MDH-1是MDH-C2,MDH-2, MDH-3,MDH-4分別是MDH-A2, MDH-AB, MDH-B2。基因座位A和B之間可以雜交, 座位C不可以和基因座位A和B雜交。MDH和ME 是生物氧化的重要酶類,主要催化蘋果酸與丙酮酸、草酰乙酸之間的相互轉(zhuǎn)化。因此這些酶在各個組織中大量存在, 并且活性較強。在肌肉、肝臟等新陳代謝比較旺盛的組織中,它們的活性就相對較強。

EST是催化酯類化合物水解進入中間代謝的重要水解酶, 在細胞內(nèi)執(zhí)行最基本的生理功能。它們能水解大量非生理存在的酯類化合物,包括一些藥物,因此認為可能有去毒作用。肝、腎是機體最重要的解毒器官, 所以在肝、腎中酯酶同工酶的形式較多,而且活性較強, 這與黃福勇在鳧溪香魚研究中報道的結(jié)果相一致[16]。腸是消化脂肪等酯類的主要器官,因此酯酶在腸中活性也較強。

SOD是生物體防御氧化損傷的重要酶類,能清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基 O-。機體在正常代謝過程中產(chǎn)生自由基O-, 且外界環(huán)境因素能增加細胞中自由基O-的濃度, 若不能及時清除, 會引起生物膜的過氧化損傷, 甚至造成細胞器的損害以及DNA與蛋白質(zhì)等的降解與失活。管丹東[18], 黃福勇等[16]在大黃魚和香魚的研究中, 發(fā)現(xiàn) SOD在脾臟和肝臟的活性較強。然而日本鬼鲉在腸和鰓中 SOD的活性比較強,這可能與日本鬼鲉自身的棲息方式有關(guān)。作為近海的一種底棲魚類, 它的腸道、鰓幾乎和近海的淤泥直接接觸。從而使腸道和鰓最容易受到外界病原體和不利條件影響,因此在腸和鰓中SOD的活性比較強。這與生活在淤泥中泥蚶(Tegillarca granosa)的消化腺中SOD的強活性相一致[23]。POD利用H2O2氧化供氫體, 降解嘌呤、酚和胺等物質(zhì)并減輕其毒性[24]。脾是重要的免疫器官, 肝臟則是機體最重要的解毒器官, 因此POD在脾臟、肝臟和腸道中的種類比較多,且活性也相對較高。管丹東等[18]大黃魚的POD酶譜分析中, 也發(fā)現(xiàn)在脾臟、肝臟中POD表達酶帶較多且活性較強。

綜合 8個同工酶譜來看, 肝臟作是機體最為重要的器官之一, 各種同工酶在其中不但種類最多而且活性強。

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Distribution of eight enzymes in various organs of Inimicus japonicus

DONG Xu-hui, LI Ming-yun
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Nov., 26, 2009

Inimicus japonicus; isozyme; tissue specific expression

Eight isozymes in nine organs of Inimicus japonicus were studied by vertical polyacrylamide gel electrophoresis. Succinatedehydrogenase (SuDH) existed in all organs, showing little differences. Lactic dehydrogenase(LDH), malate dehydrogenase (MDH), malic enzyme(ME), esterase(EST), alcoholdehydrogenase (ADH), peroxidase(POD), and superoxide dismutase(SOD) showed clearly tissue-specific distributions.

S917.4

A

1000-3096(2010)10-0018-06

2009-11-26;

2010-04-10

長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT0734)項目

徐輝(1985-), 男, 浙江人, 碩士研究生, 研究方向： 種質(zhì)種苗創(chuàng)新, 電話： 13857476758 E-mail：dxh8597@126.com; 李明云,通信作者, 電話： 0574-87609571 ,E-mail： limingyun@nbip.net

(本文編輯： 譚雪靜)