薰衣草花抗大鼠心肌缺血再灌注損傷作用

付偉，楊彩玉，劉婷，李德芳，王振華，鄭秋生，袁呈山，王春明

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002；2蘭州大學(xué)功能有機(jī)分子化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730000；3蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730000）

薰衣草花抗大鼠心肌缺血再灌注損傷作用

付偉1，楊彩玉1，劉婷1，李德芳1，王振華1，鄭秋生1，袁呈山2，王春明3

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002；2蘭州大學(xué)功能有機(jī)分子化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730000；3蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730000）

為觀察傳統(tǒng)維藥薰衣草花對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷（I／R）是否具有保護(hù)作用，采用改良的Langendorff逆行恒壓灌流方法，用停灌／復(fù)灌方法建立大鼠離體心臟全心I／R損傷模型，采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈方法建立離體心臟局灶I(lǐng)／R模型。通過記錄再灌注過程中左室發(fā)展壓（LVDP）、左心室內(nèi)壓最大上升／下降速率（±dp／dtmax）、冠脈流量（CF）和心率（HR）觀察薰衣草花水煎液（LAE）對(duì)全心缺血再灌注損傷心臟心功能的影響，測(cè)定冠脈流出液中乳酸脫氫酶（LDH）和心肌肌酸激酶（CK）水平以及心肌組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平；采用伊文斯藍(lán)和TTC雙染法觀察薰衣草花水煎液對(duì)局灶性I／R損傷面積的影響。結(jié)果顯示：與模型組相比，LAE預(yù)處理能減少心肌梗死面積，明顯升高缺血再灌注損傷心臟的左室發(fā)展壓（LVDP）、左心室內(nèi)壓上升最大速率（＋dp／dtmax）和下降最大速率（－dp／dtmin），并增加冠脈流量（CF）；降低冠脈流出液中與心肌組織損傷相關(guān)的LDH和CK水平；升高心肌組織SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化物MDA的產(chǎn)生。由此可知，薰衣草花對(duì)心肌缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用，其作用可能與其改善缺血再灌注心肌組織氧化脅迫狀態(tài)有關(guān)。

薰衣草花；水煎液；缺血再灌注損傷；離體心臟

維吾爾族習(xí)用慣藥材薰衣草系唇形科植物狹葉薰衣草（Lavandula augustifolia Mill．）的干燥地上部分，維吾爾族語名為吾斯提庫都斯。維吾爾醫(yī)認(rèn)為薰衣草性質(zhì)為二級(jí)濕熱，能消散寒氣、補(bǔ)胃理腦、燥濕止痛，用于胸腹脹滿，感冒咳喘，頭暈頭痛，心悸氣短，關(guān)節(jié)骨痛等的治療，另外部頒標(biāo)準(zhǔn)中多個(gè)補(bǔ)益心腦的傳統(tǒng)維藥復(fù)方中均含有薰衣草?，F(xiàn)代藥理研究表明，薰衣草精油具有抑菌、抗炎、抗焦慮、維護(hù)心臟自律性反應(yīng)、清除自由基等活性［1－5］。但傳統(tǒng)維藥中薰衣草以煎煮方法應(yīng)用，煎煮過程中精油基本揮發(fā)，其有效成分應(yīng)保留在水煎液中。

本研究依據(jù)薰衣草作為傳統(tǒng)維吾爾藥的適應(yīng)癥，采用離體心臟缺血再灌注損傷模型，考察了薰衣草花水煎液對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF級(jí) Wistar大鼠，體重250～300 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（新）2003－0002。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)試劑

薰衣草花（伊帕爾汗公司）；心肌肌酸激酶（CK）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）、伊文斯藍(lán)為美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)所需溶液均采用Milli－Q Biocel系統(tǒng)制備超純水配置。

1．2 薰衣草花水煎液的制備

稱取100g薰衣草花，加入到圓底燒瓶中，加入300mL的蒸餾水浸泡30min，再加入200mL蒸餾水，加熱回流1h，過濾，收集濾液；于濾渣中再次加入300mL蒸餾水，加熱回流1h，過濾，收集濾液；于濾渣中繼續(xù)加入200mL蒸餾水，加熱回流0．5h，過濾，收集濾液；將3次濾液合并，55℃減壓濃縮為500 mg／mL（按含有生藥量計(jì)），經(jīng)0．22μm除菌濾膜過濾除菌，冷藏備用。本研究中薰衣草花水煎液（LAE）濃度均以單位體積內(nèi)薰衣草花的生藥量表示。

1．3 離體心臟缺血再灌注損傷模型復(fù)制及指標(biāo)測(cè)定

按課題組已建立方法［6］復(fù)制大鼠離體心臟缺血再灌注模型。Wistar大鼠腹腔注射肝素鈉500U／kg抗凝，15min后以10%水合氯醛（350mg／kg，ip）麻醉。開胸取心，立即置于4℃K－H液中，輕擠心臟，排出余血，迅速行主動(dòng)脈逆行插管，將心臟固定于Langendoff灌流裝置上，保持自搏心率，以95%O2和5%CO2混合氣體充分飽和的K－H緩沖液（pH＝7．4）恒壓逆行灌流。在肺動(dòng)脈圓椎部位剪一小口，以利于K－H液經(jīng)冠脈循環(huán)排出。

離體心臟全心缺血／再灌注損傷模型及分組給藥處理如下：剪開左心耳，球囊導(dǎo)管從左心耳插入左心室，球囊內(nèi)壓調(diào)至5～10mmHg。球囊導(dǎo)管連接壓力換能器，與生物多導(dǎo)儀（PowerLab 4SP）相連，連續(xù)記錄左心室收縮壓（LVSP），以軟件自動(dòng)分析缺血再灌注前后左心室發(fā)展壓（LVDP）、左室內(nèi)壓最大上升／下降速率（±dp／dtmax）和心率（HR），以計(jì)滴器實(shí)時(shí)記錄冠脈流量（CF）。

離體心臟分組處理如下：

1）正常組：以K－H液平衡灌流90min；

2）模型組：以K－H液平衡灌流30min，停灌20 min，再灌40min；

3）薰衣草花水煎液（LAE）組：平衡灌流20 min，改用含50mg／L LAE的K－H液灌流10min，之后停灌20min，K－H液再灌40min。

用生理記錄儀記錄灌流全過程心功能變化情況，以軟件自動(dòng)分析再灌注15min、30min和40 min時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)情況以反映心功能狀況。用恢復(fù)率表示，以缺血前20min平均值為100%，再灌注期各時(shí)間點(diǎn)換算為缺血前20min的百分率。于再灌注20min和40min收集冠脈流出液，按試劑盒說明書分別測(cè)定LDH和CK水平。灌流結(jié)束后，迅速取下心臟，剪下左心室，濾紙吸干水分后稱重，加入10倍量冰生理鹽水后勻漿。勻漿液于10，000g離心10min，收集上清，按試劑盒說明書測(cè)定SOD和MDA水平。

離體心臟局灶性缺血／再灌注損傷模型及分組給藥處理如下：

1）模型組：以K－H液平衡灌流30min后，以6．0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，造成局灶缺血30 min，隨后松開絲線，再灌注120min。

2）薰衣草花水煎液（LAE）組：平衡灌流20 min，改用含50mg／L LAE的K－H液灌流10min，以6．0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，造成局灶缺血30min，隨后松開絲線，再灌注120min。再灌注結(jié)束時(shí)，將絲線再次結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，經(jīng)灌流針從主動(dòng)脈注入0．2mL的2%伊文思藍(lán)，用PBS溶液將心臟沖洗后冷凍于－20℃，將心臟切成約1mm厚的薄片，在37℃水浴中再用1%TTC孵育10～15 min。心臟未缺血區(qū)被染成藍(lán)色，缺血未壞死區(qū)呈深紅色，缺血壞死區(qū)呈白色。采用Image Pro Plus 5．0圖像處理軟件，計(jì)算未缺血、缺血未壞死和缺血壞死區(qū)心肌面積。

1．4 薰衣草花水煎液濃度的選擇

利用離體心臟全心缺血／再灌注損傷模型，觀察不同濃度的薰衣草花水煎液對(duì)再灌注30min時(shí)心肌功能LVDP的影響，選擇最佳濃度。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉχ±S表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均值比較，P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 薰衣草花水煎液濃度選擇

結(jié)果（圖1）表明，不同濃度LAE處理后心臟再灌注30min，20mg／L～50mg／L LAE可濃度依賴性增加I／R損傷后LVDP的恢復(fù)率，50mg／L時(shí)達(dá)最大值。但當(dāng)LAE濃度高于50mg／L時(shí)（70mg／L和100mg／L），離體心臟I／R后LVDP恢復(fù)率反而隨濃度的升高而降低，表明LAE對(duì)離體心臟I／R損傷具有雙向調(diào)控作用。

本研究觀察LAE對(duì)心臟I／R損傷保護(hù)作用，選用50mg／L LAE預(yù)處理濃度。LVDP（%）＝再灌注30min時(shí)／缺血前20min時(shí)×100%，n＝5。

圖1 不同濃度的薰衣草花水煎液對(duì)I／R的LVDP的影響Fig．1Effect of different concentration lavandula decotion（LAE）on the left ventricular developed pressure（LVDP）in ischemia／reperfusion（I／R）injured isolated rat heart

2．2 薰衣草花水煎液對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注心功能的影響

結(jié)果見表1。由表1可知：大鼠離體心臟全心缺血再灌注損傷可致各時(shí)間點(diǎn)LVDP、±dp／dtmax、CF均明顯降低（P＜0．01），HR減慢（P＜0．01）。50mg／L薰衣草花水煎液預(yù)處理可明顯改善缺血再灌注所致上述的心功能受損情況，促進(jìn)LVDP和±dp／dtmax的恢復(fù)（P＜0．01），對(duì)心率的恢復(fù)也有一定作用（P＜0．01，30min）（P＜0．05，40min），薰衣草花水煎液預(yù)處理可明顯增加離體心臟I／R損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的冠脈流量（P＜0．05）。

2．3 薰衣草花水煎液對(duì)局灶性心肌缺血梗死面積的影響

圖2a和圖2b分別示典型I／R組和薰衣草水煎液處理組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈后心肌染色結(jié)果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖2c）表明，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支可造成約50%左心室心肌組織發(fā)生缺血再灌注損傷，I／R對(duì)照組缺血面積為（55．0±6．32）%，LAE處理組缺血區(qū)面積為（53．4±5．54）%，兩組未見明顯差別；但I(xiàn)／R組心肌組織壞死區(qū)面積占缺血區(qū)面積的（20．1±3．55）%；50mg／L LAE處理組缺血壞死區(qū)僅占缺血區(qū)的（10．0±2．54）%，兩組比較具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。說明LAE預(yù)處理雖不能減少結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支所致的缺血發(fā)生，但可明顯減輕I／R所致心肌組織壞死。

表1 薰衣草花水煎液對(duì)大鼠離體心缺血再灌注心功能的影響ˉχ±S，n＝8Tab．1Effects of lavandula decotion（LAE）on myocardial function during reperfusion in isolated rat heart

圖2 薰衣草花水煎液對(duì)局灶性缺血再灌注損傷所致心肌梗死面積的影響Fig．2Protective effect of lavandula decotion（LAE）on myocardial infarct size

2．4 薰衣草花水煎液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠離體心臟冠脈流出液CK和LDH水平的影響

結(jié)果見表2。

由表2可見，停灌前各組冠脈流出液中CK和LDH水平均與正常組相當(dāng)，再灌注后，I／R組冠脈流出液中CK和LDH水平明顯升高（P＜0．01vs正常組），50mg／L薰衣草花水煎液處理后，冠脈流出液中CK和LDH水平明顯降低（P＜0．05vs I／R組）。這表明薰衣草花水煎液能夠?qū)θ毖俟嘧⑺滦募〖?xì)胞損傷有保護(hù)作用。

表2 薰衣草花水煎液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠離體心臟冠脈流出液CK和LDH活性的影響，n＝8Tab．2Effect of lavandula decotion（LAE）on the activities of creatine kinase（CK）and Lactate dehydrogenase（LDH）in coronary flow liquid after ischemi－reperfusion（I／R）injury

表2 薰衣草花水煎液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠離體心臟冠脈流出液CK和LDH活性的影響，n＝8Tab．2Effect of lavandula decotion（LAE）on the activities of creatine kinase（CK）and Lactate dehydrogenase（LDH）in coronary flow liquid after ischemi－reperfusion（I／R）injury

注：與正常組比較，a表示P＜0．01；與模型組比較，b表示P＜0．01，c表示P＜0．05。

組別 停灌前 再灌注后20min 40min CK／（U／L）正常組 13．7±6．25 9．10±4．71 8．20±5．02 I／R 組 13．6±4．96 49．3±20．43a57．5±15．54a LAE組 14．1±5．60 17．1±8．54b 23．7±11．43b LDH／（U／L）正常組 11．3±2．78 10．1±2．05 9．70±2．34 I／R 組 11．4±5．34 26．2±7．34a23．3±8．40a LAE 組 12．8±3．45 16．4±5．35b 18．4±7．56c

2．5 薰衣草花水煎液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠離體心臟心肌組織SOD和MDA水平的影響

結(jié)果見表3。由表3可知：I／R損傷后，心肌組織中SOD活性明顯降低（P＜0．01），MDA水平顯著升高（P＜0．01），表明I／R可致心肌組織發(fā)生嚴(yán)重的氧化脅迫損傷。50mg／L LAE預(yù)處理后I／R損傷離體心臟心肌組織SOD活性明顯高于I／R組（P＜0．01），而 MDA含量明顯降低（P＜0．01），表明薰衣草花水煎液預(yù)處理可改善I／R所致心肌組織氧化脅迫狀態(tài)，從而保護(hù)心肌組織。

表3 薰衣草花水煎液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠離體心臟心肌組織SOD和MDA水平的影響，n＝8Tab．3Effects of lavandula decotion（LAE）on SOD activity and MDA level after ischemia／reperfusion（I／R）injury in isolated rat heart

表3 薰衣草花水煎液對(duì)缺血再灌注損傷大鼠離體心臟心肌組織SOD和MDA水平的影響，n＝8Tab．3Effects of lavandula decotion（LAE）on SOD activity and MDA level after ischemia／reperfusion（I／R）injury in isolated rat heart

注：與正常組比較，a 表示P＜0．01；與模型比較，b 表示P＜0．01。

組別 劑量／（mg／L）再灌注后SOD／（U／mg Prot） MDA／（μmol／kg Prot）9．81±0．41 188．2±25．02模型組 — 3．23±0．63a 457．5±30．54a LAE 組 50 7．01±0．45b 223．7±31．43正常組 —b

3 討論

心功能的改變?yōu)樾募∪毖俟嘧p傷的主要表現(xiàn)之一，具體表現(xiàn)為再灌注損傷后血流的恢復(fù)與心功能恢復(fù)不一致，甚至惡化導(dǎo)致患者死亡。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，缺血再灌注后LVDP降低，＋dp／dtmax和－dp／dtmin均下降，CF減少，HR減慢，結(jié)果與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，薰衣草花水煎液處理可增加再灌注后的CF，改善心臟功能，升高LVDP和±dt／dpmax，提高HR。I／R可造成細(xì)胞膜通透性升高，細(xì)胞內(nèi)的某些酶可游離至細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)，如LDH和CK，可作為評(píng)價(jià)心肌損傷程度的標(biāo)志物［8］。本實(shí)驗(yàn)表明薰衣草花水煎液可減少冠脈流出液中LDH和CK水平，并對(duì)I／R所致缺血心肌壞死有明顯抑制作用，進(jìn)一步表明薰衣草水煎液對(duì)I／R所致心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

研究表明，心肌缺血再灌注過程可產(chǎn)生大量活性氧，可造成構(gòu)成生物膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，以致細(xì)胞的膜功能遭到破壞［9］。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量間接反映機(jī)體組織氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD可直接清除超氧陰離子，是維持機(jī)體氧化還原平衡狀態(tài)的重要抗氧化酶之一，SOD和MDA是目前公認(rèn)的能反映氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的指標(biāo)［10］。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注后大鼠離體心肌組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，表明心肌組織處于嚴(yán)重的氧化脅迫狀態(tài)。薰衣草花水煎液預(yù)處理后缺血再灌注心肌組織SOD活性明顯升高，而MDA水平降低，充分表明薰衣草花水煎液對(duì)缺血再灌注所致氧化脅迫損傷有保護(hù)作用。

總之，薰衣草花水煎液中含有心臟保護(hù)的活性成分，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。本研究為傳統(tǒng)維藥薰衣草的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，對(duì)其活性成分的進(jìn)一步追蹤有望尋找到新的心臟保護(hù)藥物。

［1］Shaw D，Annettb J M，Ohertyc B D，et al．Anxiolytic effects of lavender oil inhalation on open－field behaviour in rats［J］．Phytomedicine，2007，14：613－620．

［2］Gulcin I，Gungor Sat I，Sukri，et al．Comparison of antioxidant activity of clove（Eugenia caryophylataThunb）buds and lavender（Lavandula stoechas L．）［J］．Food Chemistry，2004，87：393－400．

［3］Tanida M，Yamatodani A，Akira Niijima，et al．Anxiolytic effects of lavender oil inhalation on open－field behaviour in rats［J］．Neuroscience Letters，2007，413：177－182．

［4］Sosa S，Altinier G，Politi M，et al．Extracts and constituents of Lavandula multifida with topical anti－inflammatory activity phytomedicine［J］．Phytomedicine，2005，12（4）：271－277．

［5］Vokou D，Vareltzidou S，Katinakis P．Effects of aromatic plants on potato storage：sprout suppression and antimicrobial activity［J］．Agriculture，Ecosystems ＆ Environment，1993，47（3）：223－235．

［6］付偉，劉婷，楊彩玉，等．天山花楸葉總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)．2010，26（2）：251－254．

［7］黃志華，李良東，肖海，等．3＇－大豆苷元磺酸鈉對(duì)心肌缺血／再灌注損傷及抗氧化作用的影響［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（4）：481－483．

［8］Zheng W，Huang，L Z，Zhao L，et al．Superoxide dismutase activity and malondialdehyde level in plasma and morpho－logical evaluation of acute severe hemorrhagic shock in rats［J］．Am J Emerg Med，2008，26：54－58．

［9］Zhao J，Huang X，Tang W，et al．Effect of oriental herbal prescription Guan－Xin－Er－Hao on coronary flow in healthy volunteers and anti－apoptosis on myocardial ischemia－reperfusion in rat models［J］．Phytother Res，2007，21：926－931．

［10］Fang Y Z，Yang S，Wu G．Free radicals，antioxidants，and nutrition［J］．Nutrition，2002，18（10）：872－879．

Protective Effects of Lavandula on Myocardial Ischemia
／Reperfusion Injury in Isolated Rat Heart

FU Wei1，YANG Caiyu1，LIU Ting1，LI Defang1，WANG Zhenhua1，ZHENG Qiusheng1，YUAN Chengshan2，WANG Chunming3
（1School of Pharmacy／Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Ministry of Education，Shihezi University，Shihezi 832002，China；2State Key Laborafory of Applied Organic Chemistry／College of Chemistry and Chenical Engineering；Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

To investigate the cardioprotective effects of lavandula on ischemia／reperfusion injury（I／R）in isolated rat heart，the myocardial I／R injury of rat isolated heart was prepared by Langendorff retrograde perfusion technology．The heart was pre－perfused with K－H solution containing lavandula decotion（LAE，50mg／L）for 10min before 20－minute global ischemia or 30－minute focal ischemia，then the reperfusion with K－H solution was conducted for 40min．The left ventricular developed pressure（LVDP），the maximum up／down rate of left ventricular pressure（±dp／dtmax）were recorded by physiological recorder as the myocardial function and the myocardial infarct size was detected by TTC staining．Lactate dehydrogenase（LDH）and CK activities in the effluent were measured to determine the myocardial injury degree．The su－peroxide anion dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）in myocardial tissue were detected to determine the oxidative stress degree．Results The pre－treatment with 50mg／L LAE significantly decreased the myocardial infarct size，while increased the LVDP，±dp／dtmaxand the coronary artery flow in isolated rat heart．The treatment of LAE also decreased the LDH and CK activities in the effluent and MDA in myocardial tissue．LAE treatment increased the SOD activities in myocardial tissue．Lavandula possesses the cardioprotective effect against the I／R injury and the antioxidative activity may mediate its efficacy．

Lavandula；decotion；ischemia／reperfusion injury；isolated heart

R966

A

2010－01－05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30760058），新疆兵團(tuán)醫(yī)藥衛(wèi)生專項(xiàng)（2007GG23），新疆兵團(tuán)博士資金項(xiàng)目（2008GC－12），新疆兵團(tuán)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（2007JC03）

付偉 （1983－），男，碩士生，專業(yè)方向?yàn)樾难芩幚韺W(xué)。

王振華（1973－），男，副教授，從事細(xì)胞和分子藥理學(xué)研究；e－mail：zhenhuawang＠tom．com。