小鼠精原干細(xì)胞體外分化中Stra8、mina53表達(dá)的研究

王寶峰，王菊，謝松松，周宗瑤

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，石河子832002）

小鼠精原干細(xì)胞體外分化中Stra8、mina53表達(dá)的研究

王寶峰，王菊，謝松松，周宗瑤

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，石河子832002）

為檢測(cè)Stra8、mina53在小鼠精原干細(xì)胞（mouse spermatogonial stem cells，mSSCs）體外分化中的表達(dá)，采用1）體外培養(yǎng)mSSCs并通過(guò)全反式視黃酸（ATRA，all－trans retinoic acid）進(jìn)行誘導(dǎo)分化；2）通過(guò)間接免疫熒光反應(yīng)鑒定mSSCs體外分化前后情況；3）通過(guò)RT－PCR檢測(cè)mSSCs誘導(dǎo)分化前后（0h，2h，72h）Stra8、mina53mRNA的水平，初步了解Stra8、mina53的表達(dá)狀況。結(jié)果表明：1）形態(tài)學(xué)變化顯示ATRA使mSSCs向精母細(xì)胞方向發(fā)生了分化，并通過(guò)間接免疫熒光反應(yīng)進(jìn)行鑒定。2）Stra8在mSSCs誘導(dǎo)分化2h、72h的水平高于成年小鼠和未誘導(dǎo)分化的水平，其中72h時(shí)水平低于2h，各對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3）mina53的表達(dá)在誘導(dǎo)后增加，其水平高于成年小鼠和未誘導(dǎo)mSSCs的水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明ATRA在體外使mSSCs向精母細(xì)胞方向分化，Stra8基因呈高表達(dá)，但mina53基因呈高表達(dá)不確定。

精原干細(xì)胞；Stra8；mina53；全反式視黃酸；分化；增殖

精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）作為成體干細(xì)胞的一種，是雄性動(dòng)物成體內(nèi)唯一可復(fù)制的二倍體的永生細(xì)胞。SSCs可能通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂兩種機(jī)制分化為新的干細(xì)胞和子代細(xì)胞，進(jìn)而最終分化為精子。Stra8是Stra（stimulated by retinoic acid）系列基因之一，是 Nayernia等［1］在小鼠P19細(xì)胞中分離出的視黃酸誘導(dǎo)表達(dá)基因片段。研究表明：Stra8與精子和卵子發(fā)生有關(guān)，可能參與減數(shù)分裂過(guò)程的調(diào)控［2］。mina53編碼一個(gè)53kd的蛋白質(zhì)，是Myc的靶基因，在體內(nèi)c－Myc通過(guò)與mina53的啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞增殖［3］。同時(shí)有研究提示mina53編碼的蛋白表達(dá)于睪丸未分化SSCs及減數(shù)分裂前期的精母細(xì)胞［4］。

本文旨在采用全反式視黃酸誘導(dǎo)小鼠SSCs體外分化的手段，對(duì)Stra8、mina53在mSSCs體外誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)情況進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和儀器

L－DMEM培養(yǎng)基 （GIBCO 公司），胎 牛血 清（FBS，Hycolon），PBS緩沖鹽（Sigma公司，D5652），胰蛋白酶（華美公司），LIF（ESGRO，Chemicon公司），Oct－4多克隆抗體、兔抗c－kit多克隆抗體 、兔抗GCNF多克隆抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Chemicon公司），ATRA（全反式視黃酸，Sigma公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo－Forma，USA），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，Japan），離心機(jī)（Anke TDI－40B，上海華亭科學(xué)儀器廠）。

1．2 SSCs的培養(yǎng)與體外誘導(dǎo)分化

選擇出生后6～8dBALB／c小鼠（購(gòu)買于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），頸椎脫臼處死，無(wú)菌環(huán)境取出睪丸置入盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下進(jìn)行白膜的剝除；在超凈工作臺(tái)內(nèi)再次用PBS沖洗，將組織塊剪碎，移入離心管，進(jìn)行吹打，此后以1000r／min轉(zhuǎn)速，離心5min；傾去上清，加入10倍于組織塊的I型膠原酶（1g／L）37℃ 孵化6～8min，每2～3min震蕩1次，孵化后吹打混勻，1000r／min轉(zhuǎn)速，離心5min；傾去上清，加入10倍于組織塊的0．25%胰酶37℃孵化5min，在倒置相差顯微鏡下見(jiàn)曲精小管軟散，可見(jiàn)單細(xì)胞或成團(tuán)細(xì)胞即可；加入含10%FBS的DMEM終止消化；再次進(jìn)行吹打、離心、棄上清。向離心管中加入含10%FBS、LIF的L－DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行吹打混勻，將所制細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶，放入34℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。每12h在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3d進(jìn)行一次細(xì)胞換液；按上述方法制成細(xì)胞懸液，在放置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，為進(jìn)行間接免疫熒光做準(zhǔn)備。

ATRA誘導(dǎo)劑的配制 將50mg的ATRA（摩爾質(zhì)量：300．4g／mol）粉末溶入166．44mL預(yù)先配制好的L－DMEM培養(yǎng)基中，配制成濃度為1mmol／L的誘導(dǎo)劑母液，置于磁力攪拌器上中速攪拌，一次性慮器過(guò)濾，分裝入滅菌處理過(guò)的500μL的EP管中，封口，放入－80℃冰箱保存。全操作過(guò)程避光。工作液配制方法：取100mL含10%FBS的LDMEM培養(yǎng)基，加入100μL的誘導(dǎo)劑母液，配制成濃度為1．0×10－5mol／L的工作液，溫和振蕩后封口，放入黑袋內(nèi)置于4℃冰箱保存。

mSSCs誘導(dǎo)細(xì)胞的培養(yǎng) 將貼壁后的mSSCs傾去培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，移入濃度為1．0×10－5mol／L的ATRA誘導(dǎo)劑，錫箔紙包繞培養(yǎng)瓶，僅留瓶口。同時(shí)用含10%FBS的L－DMEM培養(yǎng)基平行培養(yǎng)mSSCS細(xì)胞，作為對(duì)照。誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)為2h，72h。

1．3 SSCs的GCNF、Oct－4和c－kit的間接免疫熒光染色

取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片，用PBS緩沖液沖洗3次，置于75%酒精中室溫固定20min。以下操作均在濕盒中進(jìn)行：用PBS緩沖液沖洗玻片3次，每次5 min；用10%山羊血清的封閉液室溫封閉30min，消除抗體非特異結(jié)合；提前5min配制一抗；抗體稀釋濃度：GCNF（1∶800），Oct－4（1∶200），c－kit（1∶50）；按上述稀釋濃度分別滴加一抗，4℃過(guò)夜，空白對(duì)照組用PBS替代；次日清晨用PBS沖洗玻片3次，每次5min，滴加二抗異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶100），室溫孵育2h，注意避光；用PBS沖洗玻片3次，每次5min；最后用50%甘油PBS封片，Carl Zeiss激光共聚焦觀察并掃描成像。

1．4 RT－PCR 檢 測(cè)SSCs誘 導(dǎo) 分 化 前 后Stra8、mina53的mRNA表達(dá)情況

取成年小鼠睪丸組織作為陽(yáng)性對(duì)照組，ATRA誘導(dǎo)分化組（2h，72h），未誘導(dǎo)組為陰性對(duì)照組，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行β－actin、Stra8、mina53基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳后，用BIORAD凝膠成像分析系統(tǒng)系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)各組間mRNA表達(dá)進(jìn)行處理和灰度比較。結(jié)果均經(jīng)β－actin校正。各基因由基因庫(kù)中差得相應(yīng)的cDNA的序列，引物由北京北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

（1）引物序列：Stra8－F：5'－GCC AGA ATG TAT TCC GAG AA－3'，Stra8－R：5'－CTC ACT CTT GTC CAG GAA AC－3'；mina53－F：5'－ACC TGA CTA TTA GCA CCT ACC AG－3'；mina53－R：5'－CAC TCC TTA ATG CCA CAT CTT CC－3'；β－actin－F：5'－TGT GAT GGT GGG AAT GGG TCA G－3'；β－actin－R：5'－TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC C－3'。

（2）反應(yīng)條件：95℃ 5min；94℃30s，58℃ 1 min，（Stra8，mina53，β－actin），72 ℃ 1min，30cycles，72℃1min。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以ˉχ±S表示，應(yīng)用SPSS13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2．1 mSSCs的誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)變化

mSSCs未經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞間橋連接呈串珠狀排列；經(jīng)ATRA誘導(dǎo)72h后，單個(gè)mSSCs分裂為有細(xì)胞間橋連接的串珠狀A(yù)pr型SSCs或4、8個(gè)細(xì)胞組成的Aal型SSCs（圖1）。

圖1 SSCs的誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)變化Fig．1Morphology of mSSCs before and after induced

2．2 mSSCs誘導(dǎo)前后 GCNF、Oct－4和c－kit

間接免疫熒光反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 mSSCs誘導(dǎo)前后GCNF、Oct－4和c－kit間接免疫熒光鑒定Fig．2Expression of Oct－4 ，c－kit，GCNF by indirect immunoflurescence staining in mSSCs before and after induced

間接免疫熒光反應(yīng)檢測(cè)誘導(dǎo)前mSSCs和ATRA誘導(dǎo)72h的mSSCs顯示（圖2）：未誘導(dǎo)mSSCs的Oct－4表達(dá)呈陽(yáng)性，定位于細(xì)胞核，c－kit表達(dá)呈陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，GCNF表達(dá)呈陰性；ATRA誘導(dǎo)72h的 mSSCsOct－4、c－kit表達(dá)呈陰性，GCNF表達(dá)呈陽(yáng)性，定位于細(xì)胞核。說(shuō)明mSSCs經(jīng)ATRA誘導(dǎo)向精母細(xì)胞方向發(fā)生分化。

2．3 mSSCs誘導(dǎo)前后Stra8、mina53的mRNA的表達(dá)情況

表1所示，ATRA誘導(dǎo)mSSCs2h和72hStra8 mRNA的表達(dá)高于未誘導(dǎo)組和成年小鼠mSSCs組（P＜0．05），其中誘導(dǎo)2h組高于誘導(dǎo)72h組（P＜0．05）；ATRA誘導(dǎo) mSSCs2h和72hmina53mRNA的表達(dá)高于未誘導(dǎo)組和成年小鼠mSSCs組（P＞0．05），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同誘導(dǎo)時(shí)間mSSCs Stra8和mina53mRNA相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果，n＝3Tab．1Relative level of Stra8and mina53mRNA expression of mSSCs

表1 不同誘導(dǎo)時(shí)間mSSCs Stra8和mina53mRNA相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果，n＝3Tab．1Relative level of Stra8and mina53mRNA expression of mSSCs

注：與對(duì)照組相比P＜0．05。

組別Stra8 mina53 0h 0．9485±0．03884 0．8943±0．00559 2h 1．2649±0．04258＊ 0．9282±0．02977 72h 1．1492±0．03791＊ 0．9242±0．00129成年小鼠mSSCs組0．9972±0．05406 0．9423±0．02089

圖3 RT－PCR檢測(cè)mSSCs誘導(dǎo)前后Stra8和mSSCs誘導(dǎo)前后mina53的mRNAFig．3Stra8and mina53mRNA expression was detected by RT－PCR

3 討論

自1995年Nayernia等從小鼠P19細(xì)胞中分離出視黃酸誘導(dǎo)表達(dá)基因－Stra8以來(lái)，諸多人對(duì)其進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)［1］：1）Stra8基因表達(dá)局限于小鼠胚胎發(fā)生過(guò)程的生殖腺細(xì)胞和成年雄性小鼠減數(shù)分裂前的細(xì)胞；2）基因敲除Stra8后，幼鼠的生殖細(xì)胞早期有絲分裂過(guò)程發(fā)生紊亂，且不能進(jìn)入正常的減數(shù)分裂，同時(shí)缺失了減數(shù)分裂染色體結(jié)合、聯(lián)會(huì)重組的分子標(biāo)志。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，維甲酸直接作用于生殖細(xì)胞從而誘導(dǎo)Stra8表達(dá)，Stra8表達(dá)后啟動(dòng)減數(shù)分裂。Stra8啟動(dòng)小鼠睪丸前細(xì)線期精母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂階段，并且細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化。Anderson等［2］研究證明：在雄性小鼠，Stra8表達(dá)于精原細(xì)胞；敲除Stra8基因，精原細(xì)胞不能產(chǎn)生精子。

mina53［3］作為myc基因的靶基因，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)其的研究集中于腫瘤細(xì)胞的增殖和分化中。Mi－na53作為mina53編碼的蛋白在人類結(jié)腸腺癌食管的鱗狀上皮癌中有表達(dá)［5］。Tsuneoka等［6］發(fā)現(xiàn)Mina53表達(dá)于睪丸的未分化SSCs和減數(shù)分裂細(xì)線前期、細(xì)線期、粗線期的精母細(xì)胞中，可能mina53參與了精子發(fā)生的過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示：mSSCs在體外由ATRA誘導(dǎo)向精母細(xì)胞方向分化的過(guò)程中，Stra8的mRNA水平于誘導(dǎo)2h后增加，誘導(dǎo)72h后下降，但是均高于誘導(dǎo)前和成年小鼠；mina53的表達(dá)在誘導(dǎo)后增加，其水平遠(yuǎn)高于成年小鼠的水平。這提示：1）體外分化實(shí)驗(yàn)中ATRA促使mSSCs向精母細(xì)胞方向分化；2）ATRA可能作用2h，mSSCs即可發(fā)生分化；3）ATRA誘導(dǎo)72h時(shí)Stra8的mRNA水平下降，表明期間Stra8 mRNA水平有一個(gè)峰值階段；4）mina53mRNA水平在誘導(dǎo)分化中提高，卻高于誘導(dǎo)前和成年小鼠。Griswold等［6］研究通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)顯示：Stra8的表達(dá)從小鼠出生后6d開(kāi)始增加，與10d時(shí)達(dá)到峰值，14～18d明顯下降，但是于成年小鼠和出生后3d的小鼠水平都很低。本研究結(jié)果提示SSCs由ARTA誘導(dǎo)產(chǎn)生的分化與其自然分化的周期發(fā)生了重疊，該過(guò)程中處于減數(shù)分裂前階段即未分化的SSCs、細(xì)線前期和細(xì)線期精母細(xì)胞數(shù)目較多，從而導(dǎo)致了Stra8的這種變化。Tsuneoka等［5］的研究通過(guò)RNA干擾表明了mina53對(duì)細(xì)胞增殖的作用，因此本研究中mina53的變化可能與分裂前期細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)，但是在ATRA誘導(dǎo)分化中c－Myc基因激活是否引起SSCs數(shù)量增殖尚不確定。

鑒于以往ATRA對(duì)SSCs的誘導(dǎo)分化均在體內(nèi)進(jìn)行，我們采取了體外誘導(dǎo)分化的方式，顯然這種方式有利于避免多種因素的混合影響，并且通過(guò)SSCs標(biāo)志物的免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定其向精母細(xì)胞方向的分化。但是目前存在以下問(wèn)題：1）采取什么樣的標(biāo)準(zhǔn)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以避免SSCs人為和自然分化的重疊；2）分化過(guò)程中Stra8和mina53在蛋白水平上如何發(fā)生以及發(fā)生的機(jī)制是什么。因此我們有必要進(jìn)一步優(yōu)化ATRA對(duì)SSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化的體系，同時(shí)進(jìn)一步探討Stra8和mina53在SSCs向精母細(xì)胞方向分化的作用機(jī)制。

［1］李巍，竇中英，華進(jìn)聯(lián)，等．Stra8基因的激活與精原干細(xì)胞的特異性分化研究［J］，生物工程學(xué)報(bào)，2007，23（4）：639－644．

［2］Ericka L．Anderson，Andrew E．Baltus，Hermien L，et al．Stra8and its inducer，retinoic acid，regulate meiotic initiation in both spermatogenesis and oogenesis in mice［J］．PNAS，2008，105（39）：14976－14980．

［3］Makoto Tsuneoka，Yoshiro Koda，Mikiko Soejima，et al．A novel Myc target gene，mina53，that is involved in cell proliferation［J］．Journal of Biological Chemistry，2002，277：35450－35459．

［4］Teye K，Tsuneoka M，Arima N，et al．Increased expression of a Myc target gene mina53in human colon cancer［J］．American Journal of Pathology，2004，164：205－216．

［5］Makoto Tsuneoka，Yoshitake Nishimune，Keisuke Ohta et al．Expression of Mina53，aproduct of a Myc target gene in mouse testis［J］．International journal of andrology，2006，29：323－330．

［6］Qing Zhou，Rong Nie，Michael D．Griswold，et al．Expression of Stimulated by Retinoic Acid Gene 8（Stra8）in Spermatogenic Cells Induced by Retinoic Acid：an in vivo Study in Vitamin A－Sufficient Postnatal Murine Testes［J］．The Society for the Study of Reproduction，2008，10：1095．

A Primary Study of Gene Stra8and Gene Mina53 in the Differentiation of mSSCs in Vitro

WANG Baofeng，WANG Ju，XIE Songsong，ZHOU Zongyao
（Medical College of Shihezi University／Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi 832002，China）

To study the expression of Stra8and mina53in orientation－induced differentiation in spermatogonial stem cells in vitro．Methods：1）Separated and cultured spermatogonial stem cells in vitro．Induced mSSCs differentiate into spermatocyte orientation in vitro by ATRA．2）Markers（c－kit、Oct－4、GCNF）were detected by indirect immunofluorescene in mSSCs before and after induction．3）Spermatogonial stem cells were induced by ATRA for 2hand 72h．Meanwhile the levels of Stra8and mina53mRNA expression were detected by RT－PCR method．The results are as follows：1）The morphology change of mSSCs indirect immunoinfluorescence showed cultured mSSCs had been differetioned by the induction of ATRA．2）The levels of stra8mRNA of induced mSSCs for 2hand 72hwere higher than those of adult mouse testis and uninduced mSSCs，however，the level that mSSCs had been induced for 72hwas below to which induced for 2 h．The differences between all groups were statistical（P＜0．05）．3）The expression of mina53had been increased after mSSCs were induced．Surprisingly，the differnces between all groups weren，t statistical（P＞0．05）．The conclusion is that：ATRA might have the capability that induces mSSCs differentiate into spermatocyte orientation in vitro．The levels of stra8mRNA of induced mSSCs is upgrated，but it is yet uncertain that the gene mina53be high in vitro while those induced by ATRA．

spermatogonial stem cells；Stra8；mina53；ATRA；differentiation；proliferation

R329．28

A

2010－03－25

新疆兵團(tuán)博士資金項(xiàng)目（ZD2007JC08）

王寶峰（1980－），男，碩士生，專業(yè)方向?yàn)樯撑c發(fā)育。

周宗瑤（1966－），女，教授，從事生殖與發(fā)育方向研究；e－mail：zongyaozhou＠126．com。