小鼠體內(nèi)單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的動(dòng)態(tài)分布及病理變化

高磊，王靜梅，蔣建軍，剡根強(qiáng)，白晶

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

小鼠體內(nèi)單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的動(dòng)態(tài)分布及病理變化

高磊，王靜梅，蔣建軍，剡根強(qiáng)，白晶

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003）

為進(jìn)一步研究單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的致病機(jī)制，培養(yǎng)濃度為9×109cfu／mL單核細(xì)胞增多性李氏桿菌，采用Karber法測(cè)得該菌對(duì)小鼠的LD50為2．85×108cfu／mL。由此建立小鼠模型，然后人工腹腔感染小鼠30只，分別在感染后2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h和72h定期剖殺感染小鼠，取其臟器，采用PCR方法、分離培養(yǎng)及病理組織學(xué)方法，對(duì)感染模型小鼠體內(nèi)的單核細(xì)胞增多性李氏桿菌動(dòng)態(tài)分布及各器官的病理組織學(xué)變化進(jìn)行初步研究。結(jié)果顯示：感染2h，脾、肝、心血組織中均可檢測(cè)到單核增多性李氏桿菌DNA，同時(shí)從上述臟器也可分離到單核增多性李氏桿菌；感染6h，大腦中可檢測(cè)到單核增多性李氏桿菌DNA，并在感染后72h可分離到該細(xì)菌；感染4～6h，脾、心血、肝腦即開始出現(xiàn)病理變化和組織學(xué)變化。

單核增多性李氏桿菌；小鼠；動(dòng)態(tài)分布；病理變化

李氏桿菌是一種重要的食源性病原菌［1］，其中尤以單核細(xì)胞增多性李氏桿菌（Listeria monocytogene，LM）最為重要，該菌對(duì)人、家畜、家禽、野生動(dòng)物均有侵襲力［2］。人畜感染后，主要表現(xiàn)為腦炎、敗血癥及流產(chǎn)［3］，因此，其在公共衛(wèi)生方面有其特殊的重要性。最近的研究數(shù)據(jù)顯示，美國因李氏桿菌病所造成醫(yī)藥費(fèi)增加和生產(chǎn)率降低的比例逐年增加［4］。

近年來，有關(guān)LM對(duì)人及動(dòng)物的致病機(jī)理已成為研究的熱點(diǎn)。周霞等［5］以昆明系小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)致羔羊腦炎糞腸球菌進(jìn)行半數(shù)致死量測(cè)定、臨床癥狀觀察、細(xì)菌學(xué)和病理學(xué)檢查的研究，發(fā)現(xiàn)兩種日齡小鼠均對(duì)致羔羊腦炎糞腸球菌株易感，最佳感染途徑是腹腔注射，并從感染死亡小鼠部分實(shí)質(zhì)器官中均分離出致羔羊腦炎糞腸球菌，小鼠感染糞腸球菌與羔羊自然感染癥狀及病變相似，驗(yàn)證了動(dòng)物模型的成功建立；剡根強(qiáng)等［6］以健康的美利奴羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，靜脈注射LM，從臨床癥狀、病理剖解及組織學(xué)角度驗(yàn)證了LM的致病機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)以昆明系小鼠為模型，通過腹腔感染LM，應(yīng)用不同的方法探索LM在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律和相應(yīng)的病理學(xué)變化，以期為進(jìn)一步研究LM的致病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

致羔羊腦炎臨床分離株S－90株由石河子大學(xué)人畜共患病實(shí)驗(yàn)室分離并保存；昆明系小鼠100只購于石河子大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心；心腦浸液培養(yǎng)基購于北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：090803；主要試劑：Tag DNA聚合酶、MgCl2、10×PCR buffer、dNTP、10mg／mL蛋白酶K和Tris－HCl飽和酚（購于北京天庚生物工程公司）；伊紅、蘇木精－Fluka進(jìn)口分裝。伊紅染液的配置方法按文獻(xiàn)［7］中的方法進(jìn)行。

1．2 方法

1．2．1 LM的培養(yǎng)

將LM接種于進(jìn)口LB肉湯（含葡萄糖），于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，計(jì)數(shù)。測(cè)得LM的菌液濃度為9×109cfu／mL。

1．2．2 小鼠的LD50測(cè)定及模型建立

取36只臨床健康、體重約20g昆明系小鼠，隨機(jī)分為6組，試驗(yàn)組5組，每組6只，對(duì)照組6只。將菌液配制成9×109、9×108、9×107、9×106、9×105cfu／mL共5個(gè)稀釋度，試驗(yàn)組以腹腔注射的方式對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行接種，接種量0．2mL／鼠；對(duì)照組腹腔注射滅菌生理鹽水，注射量0．2mL／鼠。隔離飼養(yǎng)。并分別于接種后12h前每2h觀察1次，觀察7d，記錄死亡情況，以Karber法計(jì)算。

1．2．3 LM在人工感染小鼠體內(nèi)的分布檢測(cè)

1．2．3．1 小鼠臟器中LM的分離鑒定 以獲得的LD50為參數(shù)，獲得的菌液1．2×108cfu／mL，人工感染小鼠30只，分別于2、4、6、8、10、12、24h至死亡每時(shí)間段平行取小鼠的脾、心血、肝、腦，在無菌情況下，取上述各組織分別接種至心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，鏡檢觀察及PCR檢測(cè)。

1．2．3．2 建立PCR方法 分別于感染后2、4、6、8、10、12、24h取脾、腎、心血、肝、腦，采用已建立的LM PCR檢測(cè)方法［8］，所用引物參照 Deneer等［9］設(shè)計(jì)的特異性引物（主要擴(kuò)增保守的hlyA基因片段）。其擴(kuò)增的片段長度為743bp。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：10×Buffer（Mg2＋Free）2μL，DNA模板0．5μL，Taq酶 （5U／μL）0．5μL，dNTP（2．0 mmol）2．5μL，上下游引物（10μmmol／L）各0．5 μL，雙蒸水補(bǔ)足20μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性變性5min；94℃60s，57℃60s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，于4℃結(jié)束反應(yīng)。于1%瓊脂糖凝膠在0．5×TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，以出現(xiàn)743bp特異性條帶為陽性，不出現(xiàn)任何條帶則為陰性。

1．2．3．3 組織病理學(xué)觀察 分別于感染后2、4、6、8、10、12、24、48h取脾、腎、心血、腦、肝放入10%的福爾馬林溶液中，固定24h。經(jīng)過水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、H－E染色、封片。鏡檢觀察。

2 結(jié)果

2．1 臨床癥狀

36只接種小鼠中，食欲普遍降低，精神沉郁，共發(fā)病死亡12只，其中5只在接種后30～40h抽搐，角弓反張，很快死亡；7只于接種后3～5d發(fā)病死亡，死前1～3h出現(xiàn)抽搐、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀。接種后未死亡的小鼠，7d后精神、食欲等逐漸恢復(fù)正常。其中有2只感染小鼠出現(xiàn)原地轉(zhuǎn)圈等典型的神經(jīng)癥狀，但未死亡。

2．2 小鼠的LD50測(cè)定結(jié)果

通過Karber的計(jì)算方法得知，經(jīng)過試驗(yàn)得知致綿羊腦炎單核增多性李氏桿菌的LD50為2．85×108cfu／mL。

2．3 LM在人工感染小鼠體內(nèi)的分布結(jié)果

2．3．1 LM分離結(jié)果

感染后2、4、6、8、10、12、24、48、72h均可從脾臟、腎臟、心血、肝臟中分離出LM，而腦中未分離出LM。直到72h時(shí)才從腦組織中分離到LM。結(jié)果見表1。

表1 感染的小鼠組織器官中李氏桿菌的分離情況Tab．1Results of detection tissues of mouses acutly infected with Listeriamonocytogenes

2．3．2 細(xì)菌PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR檢測(cè)結(jié)果見表2和圖1。

表2 感染的小鼠組織器官中分布的細(xì)菌PCR檢測(cè)結(jié)果Tab．2Results of detection tissues of mouses acutlyinfected with Listeria monocytogenes by PCR

由表2和圖1可知：感染2h時(shí)，從肝臟、脾臟、腎臟、心血中檢測(cè)到LM的DNA，而腦中未檢測(cè)到；感染6h時(shí)，從各個(gè)組織中檢測(cè)到該菌的DNA。

圖1 小鼠感染6h后組織臟器LM DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig．1The rusult of Listeria monocytogenes with PCR in5tissues of mouse infected after 6h

2．3．3 病理剖解變化

2h和4h時(shí)，肝臟和腦無明顯的病理變化，脾臟稍有水腫；6h時(shí)，大部分小鼠的脾臟明顯腫大，發(fā)生水腫，腎臟腫大，腦部未見明顯的病理變化。肝臟腫大，紫紅色，質(zhì)脆。

2．3．4 病理組織學(xué)變化

部分臟器病理變化見圖2。

圖2 小鼠部分臟器的病理變化Fig．2Pathological changes of partial organs on mouse

在感染4h和6h時(shí)，脾臟紅髓、白髓的界限不清，白髓的淋巴濾泡不明顯，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，紅髓部分的紅細(xì)胞數(shù)量減少；腦膜稍增厚，腦膜下面的毛細(xì)血管高度擴(kuò)張，腦膜下有數(shù)量不等的單核細(xì)胞，腦神經(jīng)元（細(xì)胞）水腫比較明顯，腦神經(jīng)細(xì)胞有壞死。在腦實(shí)質(zhì)部分有壞死灶，局部壞死灶區(qū)域的細(xì)胞核溶解，可見有單核細(xì)胞，壞死灶的表現(xiàn)為灰白色的點(diǎn)狀的壞死，部分腦毛細(xì)血管表現(xiàn)有微血栓形成；大多數(shù)心肌細(xì)胞發(fā)生變性（以顆粒變性為主）及壞死（許多心肌細(xì)胞核溶解消失，成一片均質(zhì)的紅染），部分心肌肌纖維斷裂。肝臟的肝小葉尚存，結(jié)構(gòu)較清晰，高倍鏡下，有的肝細(xì)胞表面有顆粒變性，有許多肝細(xì)胞表現(xiàn)為脂肪變性，在很多肝細(xì)胞胞漿里，表現(xiàn)為大小不等的空泡。

8h后逐漸表現(xiàn)出了典型的病理變化，脾臟的吞噬細(xì)胞明顯增多，體積增大，細(xì)胞核不規(guī)則，有的脾小梁壞死，紅髓部分的淋巴細(xì)胞增多；心肌中心肌纖維實(shí)質(zhì)的小動(dòng)脈、毛細(xì)血管、小靜脈高度擴(kuò)張、淤血、充血；肝臟的肝小葉消失，許多肝細(xì)胞體積增大，表現(xiàn)大小不等的空泡；腎臟腎小球體積增大，表現(xiàn)富核現(xiàn)象，腎小球囊狹小部分腎球囊內(nèi)有絲狀的纖維蛋白，腎小管上皮細(xì)胞腫大，胞漿內(nèi)有少量淡紅色微細(xì)的蛋白顆粒，有的上皮細(xì)胞膜破裂，少量蛋白顆粒流失于管腔中，使之狹窄，不規(guī)則，呈現(xiàn)星芒狀。

3 討論

3．1 LM在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律

在感染2h時(shí)，通過分離培養(yǎng)，在脾臟、腎臟、心血、肝臟均可得到該菌。本實(shí)驗(yàn)通過建立的PCR快速檢測(cè)方法，在6h時(shí)，可在所有檢測(cè)臟器即脾臟、腎臟、肝臟、心血、腦中檢測(cè)到LM的DNA。由此可以看出，這二種方法結(jié)合，能更好的驗(yàn)證LM在動(dòng)物體內(nèi)分布情況的準(zhǔn)確性，大大增加了試驗(yàn)的可靠性。同時(shí)在4h時(shí)，剖解的小鼠各個(gè)臟器無明顯的病理變化，只是脾臟稍有腫大，而在6h時(shí)，脾臟、肝臟等發(fā)生明顯的病理變化，脾臟腫大，肝臟明顯水腫，紫紅色，這說明隨著時(shí)間的增加，LM在小鼠體內(nèi)不斷的增殖，侵襲各個(gè)臟器，造成各個(gè)臟器功能性障礙。細(xì)菌分離和PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，脾臟、肝臟、心血的檢測(cè)在最早的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)陽性結(jié)果，說明LM更易侵入上述臟器，這是快速檢測(cè)李氏桿菌病的最佳取材部位，而大腦6h時(shí)才檢測(cè)到LM的DNA，72h才從大腦分離到該菌，并在感染早期腦組織病理變化不明顯，這可能與血腦屏障免疫機(jī)制有關(guān)系，至于分離株進(jìn)入血液循環(huán)如何突破血腦屏障最終定居在腦部導(dǎo)致LM腦膜腦炎發(fā)生的機(jī)理還需更進(jìn)一步研究。

病原體在動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律是傳染病學(xué)的一個(gè)重要的組成部分，對(duì)于研究動(dòng)物的發(fā)病機(jī)理，診斷以及流行病學(xué)調(diào)查有著重要的意義，同時(shí)也提供了理論依據(jù)［5］。

3．2 LM感染小鼠后引起各組織的病理性變化和組織學(xué)變化

在LM感染4h，各個(gè)臟器沒有呈現(xiàn)明顯的病理變化，脾臟稍有腫大。6h時(shí)，各個(gè)臟器都呈現(xiàn)了不同的病理性變化，腫大脾臟明顯。腦部水腫。肝臟腫大，紫紅色，質(zhì)脆。造成這樣的病理變化是因?yàn)樵摼芮忠u腸黏膜上皮細(xì)胞及肝、脾巨噬細(xì)胞，成為胞內(nèi)寄生菌，而另一途徑則是通過損傷的黏膜經(jīng)神經(jīng)末梢的鞘膜進(jìn)犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)。相應(yīng)的組織學(xué)變化也論證了上述病理性變化，即從6h就可看到脾小梁壞死，腦膜稍增厚，腦膜下面的毛細(xì)血管高度擴(kuò)張，腦膜下有數(shù)量不等的單核細(xì)胞，腦神經(jīng)元水腫比較明顯，腦神經(jīng)細(xì)胞有壞死，心肌纖維實(shí)質(zhì)的小動(dòng)脈、毛細(xì)血管、小靜脈高度擴(kuò)張，淤血、充血，部分心肌肌纖維斷裂等等，主要器官的剖檢和病理組織學(xué)變化與文獻(xiàn)［6］報(bào)道的LM病理特征基本吻合。由此可以看出，在小鼠感染初期，LM引發(fā)炎癥，血管充血，繼而損害了血管壁的通透性，并在這一時(shí)期各組織器官的切片可以見到明顯的淤血、充血，而心血管系統(tǒng)的損傷又造成全身性的器官損傷，引起肝臟、脾臟、腎臟的變性壞死。

3．3 小鼠模型的建立

國內(nèi)學(xué)者曾用LM成功感染了綿羊、山羊、兔子，建立了動(dòng)物模型。剡根強(qiáng)等［6］利用LM感染健康的美利奴綿羊，成功的從腦、心血、淋巴結(jié)回收到了該菌，但是以綿羊作為模型，經(jīng)常會(huì)受到品種、年齡、個(gè)體差異及需進(jìn)行免疫抑制劑處理等因素限制。殷月蘭等［10］用基因雙缺失的單核細(xì)胞李氏桿菌，以小鼠為模型進(jìn)行感染動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)小白鼠模型能適應(yīng)研究不同毒株間的協(xié)同致病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過人工感染小鼠，建立了動(dòng)物模型，可重復(fù)性好。通過腹腔接種，小鼠均可以產(chǎn)生腦炎，并且能從腦組織中分離到接種菌。接種后的小鼠出現(xiàn)精神沉郁、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，死亡小鼠各實(shí)質(zhì)器官充血并發(fā)生炎癥，出現(xiàn)腦組織不同程度的水腫和壞死，與綿羊自然感染病例的剖解變化相同。該分離菌株對(duì)小鼠的LD50為2．85×108cfu／mL，相對(duì)其它病原菌的LD50要小，可能是因?yàn)長M的溶血素與毒力基因簇發(fā)生協(xié)同作用。周霞等［5］用致羔羊腦炎腸球菌感染小鼠，成功的建立了小鼠模型，并從傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、免疫組化法、PCR方法三方面很好地探索腸球菌的感染機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)在其成功基礎(chǔ)上采用分離鑒定和PCR方法，研究LM在小鼠體內(nèi)的分布及病理變化，初步掌握了LM的致病機(jī)制。

4 結(jié)論

用致綿羊腦炎單核細(xì)胞增多性李氏桿菌分離株感染小鼠，測(cè)得該菌的LD50為2．85×108cfu／mL；定期剖殺腹腔接種LM的小白鼠，感染2h，用PCR方法即從脾、肝、心血、腎組織中檢測(cè)到該菌的DNA，并從上述臟器中分離到該細(xì)菌，感染6h后，從腦組織中檢測(cè)到該菌的DNA，并在72h時(shí)在腦組織中分離到該細(xì)菌；感染6h后各個(gè)臟器出現(xiàn)明顯的病理變化，由于致綿羊腦炎的李氏桿菌在人工感染小鼠體內(nèi)分布廣泛，引起病理變化是全身性的。因此，本研究成功的建立了動(dòng)物模型。

［1］Esteban J I，Oporto B，Aduriz G，et al．Faecal shedding and strain diversity of Listeria monocytogenes in healthy ruminants and swine in Northern Spain［J］．BMC Vet Res，2009，5：2．

［2］陸承平．獸醫(yī)微生物學(xué)［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001．

［3］王志祥，王靜梅，王耀峰．單核增多性李氏桿菌多克隆抗體的制備及純化［J］．石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，7（1）：4－6．

［4］Birth，Lasse，Bente．Diversity of Listeria monocytogenes isolates from cold－smoked salmon produced in different smokehouses as assessed by random amplified polymorphic DNA analyses［J］．Inter Food Microbiol，2001，65：83－92．

［5］周霞，剡根強(qiáng)，馬勛，等．致羔羊腦炎糞腸球菌人工感染小鼠模型的建立［J］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（5）：15－17，21．

［6］剡根強(qiáng)，馬勛，屈勇剛，等．單核細(xì)胞增多性李氏桿菌人工感染綿羊試驗(yàn)［J］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（增刊）：197－198．

［7］盛彩霞，周萍．介紹一種改良伊紅染液的配置法［J］．診斷病理學(xué)雜志，2006，13（2）：160．

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［10］殷月蘭，張晨菊，田德斌，等．產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌突變株的感染動(dòng)力學(xué)研究［J］．中國獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（10）：850－853．

Distribution and Pathological Changes in Artificial Infectious Mice Model for Listeria monocytogenes

GAO Lei，WANG Jingmei，JIANG Jianjun，YAN Genqiang，BAI Jing
（Animal Science and Technology College，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In order to find out pathogenic mechanism for Listeria monocytogenes，cultivating Listeria monocytogenes whose concentration is 9×1010cfu／mL，LD50of the bacteria is 2．85×108cfu／mL caculated with Karber．27mices infected through abdominal by Listeria monocytogenes are killed at 2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h，72h．Distribution of Listeria monocytogenes and pathological changes in different argans are studied in artificial infectious mice by PCR，cultivation and pathohistoloy．Listeria monocytogenes and its DNA can be detected in spleen，liver，kidney，cardiac muscle at 2hafter artificial infectious mouse and ListeriamonocytogenesDNA can be detected in encephalon at 6h，Listeria monocytogenes can be detected in the tissues at 72h．Significant histopathological changes are observed during 4～6hin spleen，kidney，cardiac muscle，liver，encephalon．

Listeria monocytogenes；mouse；distribution；pathological change

S858．9

A

2009－11－02

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（500003120702）

高磊（1983－），男，碩士生，專業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物傳染病診斷與防治；e－mail：w．n007＠163．com。

剡根強(qiáng)（1958－），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物傳染病的診斷與防治研究；e－mail：ygq58＠shzu．edu．cn。