毛細(xì)管電泳電致化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)利多卡因

楊艷梅,劉征遠(yuǎn)

(1.承德實(shí)驗(yàn)中學(xué),河北承德 067101;2.唐山師范學(xué)院化學(xué)系,河北唐山 063000)

毛細(xì)管電泳電致化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)利多卡因

楊艷梅1,劉征遠(yuǎn)2

(1.承德實(shí)驗(yàn)中學(xué),河北承德 067101;2.唐山師范學(xué)院化學(xué)系,河北唐山 063000)

分析了各種分離條件和檢測(cè)條件對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響;并在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下,對(duì)濃度在1.0 ×10-6～1.0×10-4mol·L-1范圍內(nèi)的利多卡因進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)發(fā)光強(qiáng)度與其濃度呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為ΔI=11.74c+34.696(c:μmol·L-1),線性相關(guān)系數(shù)R2=0.991 7。方法的檢出限為1.1×10-7mol·L-1,對(duì)1.0×10-5mol·L-1的利多卡因溶液進(jìn)行10次測(cè)量,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%。

毛細(xì)管電泳;電化學(xué)發(fā)光;聯(lián)吡啶釕;利多卡因

利多卡因(結(jié)構(gòu)式如圖1),一種酰胺類中效局麻藥,具有起效快、彌散廣、穿透性強(qiáng)、安全范圍較大、無(wú)擴(kuò)張血管作用及對(duì)組織無(wú)刺激等特點(diǎn),也是抗心律失常的常用藥物之一;但是當(dāng)血藥濃度超過(guò)5μg·mL-1時(shí)出現(xiàn)中毒癥狀,超過(guò)7μg·m L-1時(shí)出現(xiàn)驚厥[1],因此其血藥濃度監(jiān)測(cè)具有重要的臨床意義。以往多采用酶免疫分析法[2]、氣相和高效液相色譜法[3]。但成本高,操作繁瑣,干擾多,色譜柱易受污染等。

本文基于利多卡因?qū)β?lián)吡啶釕的電化學(xué)發(fā)光具有增敏作用,通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件探討了一種高效、快速、靈敏、簡(jiǎn)單的測(cè)定利多卡因的方法——毛細(xì)管電泳電致化學(xué)發(fā)光法(CE2ECL)。

1 原理

Ru(bpy)32+的發(fā)光原理:一般認(rèn)為,Ru(bpy)32+由電化學(xué)氧化或還原分別產(chǎn)生 Ru(bpy)33+或 Ru(bpy)3+,二者再

圖1 利多卡因結(jié)構(gòu)式

由圖2可知:除剛運(yùn)行時(shí)受儀器本身背景噪音影響,電流值、發(fā)光強(qiáng)度均較大,但在循環(huán)幾圈后,循環(huán)伏安圖逐漸重合,發(fā)光強(qiáng)度也趨于穩(wěn)定;這說(shuō)明 Ru(bpy)32+在此電化學(xué)條件下可循環(huán)再生,發(fā)光效率高,且化學(xué)性能穩(wěn)定。

圖2 Ru(bpy)32+的循環(huán)伏安圖

Ru(bpy)32+本身在電極電位為1.00 V～1.25 V范圍內(nèi)能夠進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光反應(yīng),利多卡因的加入能夠促進(jìn)Ru(bpy)32+3的生成,使循環(huán)伏安的氧化電流顯著增大(圖3);在恒電位條件下,表現(xiàn)為其發(fā)光強(qiáng)度增大,并在化學(xué)發(fā)光圖譜上以峰的形式出現(xiàn)(圖4)。

圖3 循環(huán)伏安圖

圖4 化學(xué)發(fā)光圖

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

儀器:2A型多參數(shù)化學(xué)分析測(cè)試系統(tǒng),未涂層石英毛細(xì)管,MOTIC體式顯微鏡,電子分析天平,KQ2250E型超聲波清洗器,SZ293自動(dòng)雙重純水蒸餾器,p HS22C型酸度計(jì)。

試劑:聯(lián)吡啶釕,利多卡因,甲氧氯普胺,鹽酸,磷酸,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,氫氧化鈉,氯化鉀,A lpha A lum Ina Pow der。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 儀器的安裝

(1)毛細(xì)管的處理。毛細(xì)管在第一次使用前要按以下方法處理:依次用0.1 mol·L-1鹽酸溶液浸泡30 min,二次蒸餾水(二次水)沖洗30 min;0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液浸泡1 h,二次水沖洗30 min;磷酸鹽緩沖液(PBS)(p H=8.00, 10.0 mmol·L-1)平衡4～5 h。以后每次使用前依次用二次水、氫氧化鈉溶液(0.1 mol·L-1)、二次水、PBS(p H=8.00, 10.0 mmol·L-1)沖洗毛細(xì)管。所有溶液(包括上述處理溶液及待測(cè)定樣品溶液)進(jìn)入毛細(xì)管前均須用0.22μm醋酸纖維素膜過(guò)濾,以防止毛細(xì)管堵塞。

(2)電極的處理。工作電極處理方法:使用前將工作電極配合拋光粉(0.3μm A l2O3粉末)在拋光布上拋光,至達(dá)到鏡面效果(在高倍顯微鏡下觀察表面光滑無(wú)任何痕跡)后,用二次水進(jìn)行超聲清洗。

(3)檢測(cè)池的安裝。檢測(cè)池、工作電極、輔助電極及毛細(xì)管,裝入檢測(cè)池;在高倍顯微鏡下調(diào)節(jié)使毛細(xì)管口正對(duì)工作電極,中軸線重合,并且兩者距離為75μm[5,6]。將檢測(cè)池裝入M PI2A型多功能化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器的暗盒內(nèi)(注意:在儀器運(yùn)行時(shí)切勿打開暗盒,以免損壞光電倍增管!)。

(4)待測(cè)樣品的裝入。在進(jìn)樣托架上依次放入裝有PBS,二次水,樣品溶液的離心管,讓毛細(xì)管和毛細(xì)管電泳陽(yáng)極電極(銅絲電極)浸入液體中。

(5)酸度計(jì)的校準(zhǔn)。使用p H=4.003和p H=6.864的兩種標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液對(duì)酸度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.2.2 溶液的配制

(1)聯(lián)吡啶釕溶液。用電子天平準(zhǔn)確稱取0.074 9 g,用二次水配制濃度為10.0 mmol·L-1的溶液,再用磷酸鹽緩沖液(p H=8.00,100.0 mmol·L-1)稀釋到5.0 mmol·L-1。

(2)磷酸鹽緩沖液(PBS)。用二次水配制(1)濃度為10.0 mmol·L-1,p H為6.00～8.50(每隔0.50 p H單位取一點(diǎn))的一系列磷酸鹽緩沖液;(2)p H=7.00,濃度為20.0 mmol·L-1～80.0 mmol·L-1的一系列磷酸鹽緩沖液。上述所配磷酸鹽緩沖液的p H均需要用酸度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)。

(3)利多卡因儲(chǔ)備液。用電子天平準(zhǔn)確稱取0.005 9 g,用二次水溶解,并定容于250 mL容量瓶中,得到1.00× 10-4mol·L-1的利多卡因儲(chǔ)備液。

2.2.3 分離條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

固定檢測(cè)條件,利用上述溶液依次測(cè)量確定最佳進(jìn)樣電位、采樣時(shí)間、進(jìn)樣量、分離電壓,運(yùn)行緩沖溶液的適宜p H和最佳濃度。

2.2.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

固定分離條件,利用上述溶液依次對(duì)工作電極初始電位、檢測(cè)池中Ru(bpy)32+的濃度及檢測(cè)池中磷酸鹽緩沖液的p H和濃度進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.5 工作曲線的繪制

配制濃度為1.00×10-7～1.00×10-4mol·L-1范圍內(nèi)的一系列利多卡因的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在實(shí)驗(yàn)確定的最佳CE2ECL條件下,測(cè)定利多卡因增強(qiáng)的 Ru(bpy)32+發(fā)光強(qiáng)度(ΔI=I -I0,ΔI為增強(qiáng)的發(fā)光強(qiáng)度,I為加入利多卡因后的峰值光強(qiáng),I0為背景光強(qiáng)(基線對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)),即 Ru(bpy)32+本身產(chǎn)生的光信號(hào)大小。),以ΔI對(duì)利多卡因的濃度c進(jìn)行線性回歸,繪制工作曲線。

2.2.6 利多卡因與甲氧氯普胺的分離實(shí)驗(yàn)

在利多卡因的CE2ECL最佳條件下,對(duì)兩者混合液進(jìn)行分離并檢測(cè)各自發(fā)光信號(hào)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 分離條件的優(yōu)化

3.1.1 進(jìn)樣電壓和時(shí)間

本實(shí)驗(yàn)采用電驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣,在允許進(jìn)樣量范圍內(nèi),進(jìn)樣電壓和時(shí)間直接影響進(jìn)樣量,從而影響發(fā)光強(qiáng)度δI和柱效。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ECL光強(qiáng)隨著進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間的增加而增加(如圖5和圖6),而柱效則隨著電壓和時(shí)間的增加而降低,且峰形拖尾現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重。綜合考慮發(fā)光強(qiáng)度ΔI,柱效,峰形等因素,選擇進(jìn)樣條件為:10 kV/10 s。

圖5 進(jìn)樣電壓對(duì)ΔI的影響

圖6 進(jìn)樣時(shí)間對(duì)ΔI的影響

3.1.2 分離電壓

實(shí)驗(yàn)考察了分離電壓為10～18 kV時(shí),對(duì)ΔI和出峰時(shí)間的影響。結(jié)果表明:ΔI隨分離電壓無(wú)明顯變化,被測(cè)組分的遷移時(shí)間隨分離電壓的升高而縮短,但峰形逐漸變差,且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重,因?yàn)榉蛛x電壓過(guò)高,產(chǎn)生的焦耳熱增多?？紤]遷移時(shí)間和峰形等因素,選擇16 kV為最佳分離電壓。

3.1.3 運(yùn)行緩沖液的p H

運(yùn)行緩沖液的p H直接影響毛細(xì)管表面的zeta電勢(shì),從而影響電滲流(EOF)的方向和速率,同時(shí)運(yùn)行緩沖液的酸度也決定樣品分子的荷電狀況,從而改變分析物的遷移時(shí)間,進(jìn)而對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI產(chǎn)生很大的影響[7]。當(dāng)運(yùn)行緩沖液的p H在6.00～8.50范圍內(nèi)變化時(shí),ΔI先隨著p H的增加而增大,當(dāng)p H=7.00時(shí)ΔI達(dá)到最大值,而后隨著p H的增大ΔI反而減小(圖7)。實(shí)驗(yàn)選擇運(yùn)行緩沖液的p H值為7.00。

圖7 運(yùn)行緩沖液的p H對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI影響

3.1.4 運(yùn)行緩沖液的濃度

固定運(yùn)行緩沖液的p H=7.00,在10.0～50.0 mmol· L-1范圍內(nèi)(每隔10.0 mmol·L-1取一個(gè)點(diǎn))調(diào)節(jié)緩沖液的濃度,優(yōu)化運(yùn)行緩沖液的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在較小濃度范圍內(nèi),發(fā)光強(qiáng)度ΔI隨著濃度的增大而增大,當(dāng)濃度為30.0 mmol·L-1時(shí),ΔI值最大,且峰型較好,而后ΔI反而減小(圖8);另外,運(yùn)行緩沖液濃度越大,出峰時(shí)間隨濃度的增大而延長(zhǎng)。綜合考慮對(duì)出峰時(shí)間與發(fā)光強(qiáng)度的影響,選擇運(yùn)行緩沖液的最佳濃度為30.0 mmol·L-1。

表1 運(yùn)行緩沖液濃度對(duì)出峰時(shí)間的影響

圖8 運(yùn)行緩沖液濃度對(duì)ΔI的影響

3.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

3.2.1 工作電極電位的優(yōu)化

當(dāng)電位低于1.0 V時(shí),因Ru(bpy)32+沒有被氧化,觀察不到發(fā)光信號(hào);在1.00～1.10 V間時(shí)發(fā)光信號(hào)較弱,故本實(shí)驗(yàn)在1.10～1.24 V范圍內(nèi)研究了ΔI和工作電極電位的關(guān)系(圖9)。在電位較低時(shí),ΔI隨電極電位的增大而增大,在1.20 V達(dá)到最大值,而后隨電位的增加反而減小,這可能是因?yàn)槿芤褐械乃谎趸瘜?duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI產(chǎn)生負(fù)面影響造成的[8]。

圖9 工作電極電位對(duì)ΔI的影響

3.2.2 檢測(cè)池中Ru(bpy)32+的濃度

由Ru(bpy)32+的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)方程式(1～4)可知:一般而言,增大檢測(cè)池中Ru(bpy)32+的濃度,生成氧化態(tài)Ru (bpy)33+的量顯然會(huì)增大,相應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度也會(huì)增強(qiáng);但增大濃度有時(shí)會(huì)生成沉淀,且可能增加干擾(背景噪聲),且Ru(bpy)32+是比較昂貴的試劑,采用較高的濃度會(huì)增加測(cè)定成本,又因?yàn)?Ru(bpy)32+濃度為5.0 mmol·L-1時(shí)有較大的信噪比[9],所以本論文采用濃度為5.0 mmol·L-1的Ru(bpy)32+溶液為發(fā)光底液。

3.2.3 檢測(cè)池中PBS濃度

本實(shí)驗(yàn)研究了p H為8.00的 PBS濃度在20.0～70.0 mmol·L-1(每10.0 mmol·L-1取一個(gè)點(diǎn))范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)ΔI的影響。結(jié)果表明:PBS濃度在20.0～50.0 mmol·L-1范圍內(nèi),ΔI隨濃度的增大而增大,當(dāng)其濃度為50.0 mmol·L-1時(shí),ΔI值最大,且峰型較好;而后,發(fā)光強(qiáng)度ΔI反而減小(圖10)。故選擇檢測(cè)池內(nèi)PBS的最佳濃度為50.0 mmol·L-1。

圖10 檢測(cè)池中Ru(bpy)32+濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度ΔI的影響

3.2.4 檢測(cè)池中PBS的p H

實(shí)驗(yàn)選用50.0 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液。Ru(bpy)32+和胺類物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)很大程度上依賴于p H。在p H 6.00～9.00(每0.5個(gè)p H單位取一個(gè)點(diǎn))范圍內(nèi)考察了檢測(cè)池中PBS的p H對(duì)ΔI的影響(如圖11)。在p H較小時(shí),由于胺類物質(zhì)質(zhì)子化,ΔI小;隨著p H的增大,ΔI增大,當(dāng)p H為8.00時(shí)ΔI達(dá)到最大;此后,隨著p H的增大,ΔI減小。故實(shí)驗(yàn)選用PBS的p H為8.00。

圖11 檢測(cè)池中PBS的p H對(duì)ΔI的影響

3.3 工作曲線、檢出限和精密度的測(cè)定

3.3.1 工作曲線的繪制

按照上述實(shí)驗(yàn)方法,在實(shí)驗(yàn)確定的最佳CE2ECL條件下,測(cè)定了一系列的利多卡因標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光強(qiáng)度ΔI,并以發(fā)光強(qiáng)度ΔI對(duì)利多卡因的濃度c進(jìn)行線性回歸,繪制工作曲線。線性范圍為1.00×10-6～1.00×10-4mol·L-1,回歸方程為ΔI=11.74c+34.696(c:μmol·L-1),相關(guān)系數(shù) R2=0.991 7。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定數(shù)據(jù)

圖12 CE2ECL法測(cè)定利多卡因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2 精密度和檢出限的測(cè)定

按照繪制工作曲線的實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)1.00×10-5mol· L-1的利多卡因溶液的發(fā)光強(qiáng)度ΔI進(jìn)行了10次測(cè)量,測(cè)得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%。

表3 1.00×10-5 mol·L-1的利多卡因溶液的ΔI

以水作為為空白試劑,按照繪制工作曲線的實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)樣15次,ΔI的標(biāo)準(zhǔn)偏差sb為0.45,按照IUPAC推薦的檢出限的計(jì)算方法D=3sb/S,計(jì)算得在CE2ECL最佳條件下檢出限為1.10×10-7mol·L-1(S為線性回歸方程的斜率)。

3.4 利多卡因與甲氧氯普胺的分離與檢測(cè)

甲氧氯普胺(Metoclop ramide)是一種止吐及催吐藥,與利多卡因的結(jié)構(gòu)相似,但兩者的藥理卻相差很大;因此我們有必要對(duì)兩者進(jìn)行分離并檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)在利多卡因的最佳CE2ECL條件下對(duì)利多卡因與甲氧氯普胺的濃度比為1∶100的混合液進(jìn)行了分離測(cè)定,并實(shí)驗(yàn)了分離電壓為12.0～18.0 kV時(shí)對(duì)兩者分離度及發(fā)光信號(hào)的影響(表4)。

圖13 甲氧氯普胺結(jié)構(gòu)

表4 分離電壓對(duì)甲氧氯普胺(ΔI1)與利多卡因發(fā)光信號(hào)(ΔI2)及分離度的影響

圖14 利多卡因與甲氧氯普胺的CE2ECL圖

由表6可知,分離電壓對(duì)混合組分的遷移時(shí)間、發(fā)光強(qiáng)度、峰寬及分離度都有很大影響。隨分離電壓的升高,被測(cè)組分的發(fā)光信號(hào)逐漸變大,遷移時(shí)間縮短,但峰形有變寬趨勢(shì),且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重,因此分離度變差。這是由于毛細(xì)管的表面積與體積之比不足夠大,散熱就不夠良好,而管壁與管中心的溫差使溶液粘度改變,使正常的電滲流流型受到擾動(dòng),向流體動(dòng)力學(xué)流型轉(zhuǎn)變,使峰展寬,因此分離度降低[8],圖14是利多卡因與甲氧氯普胺的CE2ECL圖。由CE2ECL圖可知,二者在測(cè)定條件下可以完全分離,因此CE2ECL具有很好的分離能力。

4 結(jié)論

本文建立了毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定利多卡因的方法,得結(jié)論如下:

(1)最佳分離條件為:進(jìn)樣條件為10 kV/10 s,分離電壓取16 kV,運(yùn)行緩沖液采用p H=8.00、30.0 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液。

(2)最佳檢測(cè)條件為:工作電極電位為1.20 V,檢測(cè)池內(nèi)Ru(bpy)32+濃度為5.0 mmol·L-1,檢測(cè)池內(nèi)磷酸鹽緩沖液的p H值等于8.00,濃度為50.0 mmol·L-1。

(3)在CE2ECL最佳實(shí)驗(yàn)條件下,利多卡因可在較短時(shí)間內(nèi)被檢測(cè),并且其發(fā)光強(qiáng)度ΔI與濃度呈線性關(guān)系,線性范圍為1.0×10-6～1.0×10-4mol·L-1,回歸方程為ΔI=11.74c +34.696(c:μmol·L-1),相關(guān)系數(shù) R2=0.991 7,檢出限為1.10×10-7mol·L-1,濃度為1.00×10-5mol·L-1的利多卡因用實(shí)驗(yàn)建立的方法測(cè)得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%。

(4)CE2ECL方法可以有效分離利多卡因及其結(jié)構(gòu)類似物甲氧氯普胺的混合液(Rs>1),說(shuō)明該方法的分離能力強(qiáng)。

[1] 莊心良,曾因明,陳伯鑒.現(xiàn)代麻醉學(xué)[M].第三版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:951-960.

[2] Pape BE,W hiting R,Parker KM,et al.Enzyme Im-munoassay and gas2liquid chromatography compared for determination of lidocaine in serum[J].Clin Chem, 1978(24):2020-2022.

[3] Swezey CB,Ponzo JL.Anticholinergic activity in the serum of patients receiving maintenance disopyramide therapy[J].Clin Biochem,1984(17):325-329.

[4] Guo W W,Yuan J P,L IB L,Du Y,Ying EB,Wang E K.[Ru(bpy)2dppz]2+ Electrochemiluminescence Switch and Its Applications for DNA Interaction Study and Label2free A TP Aptasensor[J].Analyst,2008 (133):1209-1213.

[5] Jianguo Li,Fengjuan Zhao,Huangxian Ju.Simultaneous electrochemiluminescence determination of sulpiride and tiapride by capillary electrophoresis with cyclodex-trin additives[J].J Chromatogr B,2006(835):84-89.

[6] Cao W D,Liu J F,Yang X R et al.Electrochemical Detection for Capillary and Microchip Electrophoresis [J].Electrophoresis,2002,23(21):3683.

[7] 龔燕,孫秀蘭,邵景東.毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定雞蛋中殘留四環(huán)素類抗生素[J].食品科學(xué),2007,28 (10):470-472.

[8] 方慧群,于俊生,史堅(jiān).儀器分析[M].第一版.北京:科學(xué)出版社,2008:194.

[9] 李海娟,韓雙,胡連哲,等.聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光研究進(jìn)展[J].分析化學(xué),2009,37(11):1557.

(責(zé)任編校:趙樹文)

Detecting Attapugite with Electrochemical Luminescence by Capillary Electrophoresis

YANG Yan-mei1,LIU Zheng-yuan2
(1.Chengde Experimental Middle School,Chengde 067101,China;2.Chemical Department Tangshan Teachers College,Tangshan 063000,China)

The paper analyses the influence of various separation and detection conditions on luminous intensity and,when lidocaine is detected in the optimized experiment condition within the density between 1.0×10-6～1.0×10-4mol·L-1,it is discovered that luminous intensity are in good linear relationship with its density and equation of linear regression is△=11.74c+34.696 (c:μmol·L-1)and the linear related coefficient R2=0.9917.The detection limit of the method is 1.1×10-7mol·L-1and through 10 detections of lidocaine of 1.0×10-5mol·L-1the relative standard deviation is 1.12%.

capillary electrophoresis;electrochemical luminescence;attapugite;lidocaine

R96

A

1672-349X(2010)06-0067-05

2010-10-19

楊艷梅(1976-),女,中教一級(jí),主要從事化學(xué)研究。