反相高效液相色譜法測(cè)定女貞子中樺木醇含量

張 秋 豐， 弓 曉 杰

( 1.大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 遼寧 大連 116622;2.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 遼寧 大連 116622 )

0 引 言

女貞子為木犀科植物女貞(LigustrumLucidumAit)的干燥成熟果實(shí)，為常用中藥，是多種成藥和成方的主要組分。女貞子中含女貞子苷、齊墩果酸、熊果酸、樺木醇、甘露醇等，其中齊墩果酸、熊果酸和樺木醇均為三萜化合物，有一定的藥理活性。樺木醇對(duì)女貞子藥效有著重要的影響，因此受到廣泛關(guān)注。樺木醇是一種重要的天然生物活性物質(zhì)，具有消炎、抗病毒功能，可抑制頭發(fā)纖維中蛋白質(zhì)的溶解、改善受損頭發(fā)光澤、促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)等生理活性，可應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)[2]。三萜化合物的分析方法較多，齊墩果酸和熊果酸的多種分析方法已被大家所知，但對(duì)女貞子中樺木醇的含量測(cè)定卻未見報(bào)道。本文用RP-HPLC法對(duì)女貞子中樺木醇進(jìn)行定性定量分析，以期為女貞子成分及藥理活性研究提供參考，為藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

福立FL-2200高效液相色譜系統(tǒng)：FL-2200泵，F(xiàn)L-2200紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站；電子天平，梅特勒托利多；分析天平，北京金紫光儀器儀表公司。

樺木醇對(duì)照品由大連醫(yī)諾生物有限公司提供，經(jīng)HPLC測(cè)定純度為96.3%；所用試劑均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

女貞子藥材購自大連東特大藥房，經(jīng)大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)教研室鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實(shí)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取樺木醇對(duì)照品50 mg，溶于50 mL甲醇，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.2 樣品溶液的制備

精確稱取女貞子干燥粉末10 g，過65目篩，用正丁醇200 mL浸泡24 h，然后置超聲震蕩清洗器中，超聲20 min，過濾，分離出溶液。殘?jiān)?00 mL正丁醇同法處理，合并兩次溶液，減壓蒸干溶劑，再用25 mL甲醇溶解固體，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容搖勻。

2.3 色譜條件

色譜柱，Supelcosil LC-PAH C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相，乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=830∶170∶1]；檢測(cè)波長(zhǎng)，210 nm；體積流量，1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。樺木醇16.5 min出峰，對(duì)照品及供試品色譜圖見圖1、2。

圖1 樺木醇對(duì)照品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of betulin reference substance

圖2 女貞子藥材的 HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of sample of Fructus ligutric lucidi

2.4 線性關(guān)系考察

精確吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，得5個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)的混合對(duì)照品溶液。分別精確吸取20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程?；貧w方程為：Y=257 241X+39 628，R2=0.998 4。結(jié)果表明，樺木醇在0.1～0.8 mg/mL內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精確吸取上述質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液20 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得樺木醇峰面積的RSD為1.25%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL對(duì)照品溶液，分別于0、2、6、12、24 h，精密吸取20 μL進(jìn)樣，測(cè)得樺木醇峰面積的RSD為1.08%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批樣品5份，精密稱定，按供試品溶液制備方法分別制備5份，測(cè)定并計(jì)算樺木醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.94%。

2.8 回收率試驗(yàn)

精確稱取已知樺木醇含量樣品5份，各取1 g分別精確加入樺木醇對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理。按上述色譜條件測(cè)得樺木醇的平均回收率為98.87%，RSD為1.91%。

2.9 樣品測(cè)定

精確吸取經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過后的樣品溶液20 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中樺木醇的含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品中樺木醇的測(cè)定結(jié)果(n= 3)Tab.1 Determination of betulin in samples (n =3)

3 討 論

3.1 提取條件的選擇

根據(jù)測(cè)定目標(biāo)樺木醇的理化性質(zhì)和文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，提取溶媒應(yīng)選擇對(duì)樺木醇溶解性較好的氯仿、乙醇等物質(zhì)，最后使用對(duì)樺木醇溶解性最好的正丁醇作為提取溶劑[4]。正丁醇不僅能夠提高供試品濃度，而且能夠減少水溶性等雜質(zhì)的干擾，確定最佳提取條件為以20倍量正丁醇浸泡超聲提取2次。此方法簡(jiǎn)便易行，測(cè)定時(shí)干擾少。

3.2 色譜條件的選擇

樺木醇為五環(huán)三萜類化合物，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6]對(duì)女貞子中齊墩果酸和樺樹皮中樺木醇的測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)中曾采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸、乙腈-甲醇-水-冰醋酸等多種流動(dòng)相。其中加酸的主要作用是調(diào)整峰型，通過實(shí)驗(yàn)比較冰醋酸和磷酸，發(fā)現(xiàn)磷酸較好，峰型較理想。當(dāng)流動(dòng)相中有甲醇時(shí)發(fā)現(xiàn)女貞子中主要成分五環(huán)三萜酸類物質(zhì)(齊墩果酸等)出峰時(shí)間延后很多，與樺木醇出峰時(shí)間較接近，使樺木醇很難分離。而且樺木醇最大紫外吸收波長(zhǎng)為210 nm，紫外末端吸收，甲醇與乙腈相比，乙腈對(duì)測(cè)定干擾較少，故流動(dòng)相選用乙腈。流動(dòng)相的比例開始用樺木醇與樺木酸能夠較好分離的乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=860∶140∶1]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)女貞子中樺木醇與周圍物質(zhì)沒有完全分開，所以為了使樺木醇與周圍峰分開，延長(zhǎng)出峰時(shí)間，增加水的含量，最后確定水的體積分?jǐn)?shù)為17%。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)水的體積分?jǐn)?shù)大于24%時(shí)，雖然物質(zhì)間被進(jìn)一步分離，但樺木醇峰型較差，最后確定流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=830∶170∶1]。在此條件下，所得圖譜基線平穩(wěn)，樺木醇與周圍物質(zhì)達(dá)到了較好的分離。

女貞子是一種具有廣泛用途的常用中藥，因此對(duì)于它的化學(xué)成分和藥理活性研究較為重要。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法，流動(dòng)相，乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=830∶170∶1]；檢測(cè)波長(zhǎng)，210 nm。外標(biāo)法對(duì)女貞子中的生物活性成分樺木醇進(jìn)行定性、定量分析，不僅方法簡(jiǎn)便、易行，而且穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可以為女貞子的質(zhì)量控制提供參考，也可以為科學(xué)工作者的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

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