一種嗜堿菌微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的條件優(yōu)化

楊 大 偉， 田 晶， 苑 廣 志， 徐 龍 權(quán)

( 大連工業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代教育技術(shù)部， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

乳酸是重要的生物化工產(chǎn)品，廣泛用于醫(yī)藥、食品、飲料、日用化工、石油化工、皮革、卷煙工業(yè)等領(lǐng)域[1]。特別是近年來開發(fā)出的L-乳酸的聚合物，可生產(chǎn)生物降解的農(nóng)用地膜及其他塑料制品代替無法降解的常用塑料，能解決全球的“白色”污染問題[1]，因而乳酸有廣闊的國內(nèi)外市場。

目前乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法[2]、酶法[3]和發(fā)酵法[4]?；瘜W(xué)合成法所用的原料是乙醛和劇毒物質(zhì)氫氰酸，生產(chǎn)成本也較高，因而該法生產(chǎn)乳酸受到極大地限制。酶法生產(chǎn)乳酸雖然可以專一性得到旋光乳酸，但工藝比較復(fù)雜，應(yīng)用于工業(yè)還有待于進一步研究。微生物發(fā)酵法可通過菌種和培養(yǎng)條件的選擇而得到具有專一性的D-乳酸、L-乳酸或是DL-乳酸[5-6]，且乳酸菌具有發(fā)酵溫度高、產(chǎn)酸率相對較高、對糖利用率高、發(fā)酵時不需通氧氣等優(yōu)點，因此發(fā)酵法具有非常廣闊的前景[7-9]。

作者從14株嗜堿菌中篩選出一株性能優(yōu)良的產(chǎn)乳酸菌，并對該菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件做了初步研究，以期為極端微生物的進一步開發(fā)利用提供一些有價值的參考。

1 材料和方法

1.1 材料和菌種

14種嗜堿菌F1-2、F1-5、F27-4、288、289、CG、Tc10、SH1、SH2、XH2、LP3-1、LP3-2、LP3-3、LP3-4，中科院微生物研究所極端環(huán)境微生物組菌種保藏中心提供；P/ACE MDQ 毛細管電泳儀(Beckman公司，美國)；TJL-16G臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-82(A) 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器制作有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技； UV2450紫外分光光度計，日本島津公司；所用試劑均為分析純。

1.2 乳酸產(chǎn)生菌的篩選

將14株嗜堿菌接種到平板篩選培養(yǎng)基進行初篩。初篩得到的幾株菌經(jīng)種子培養(yǎng)基活化兩代后，按10%接種量將各株菌接種到裝液量為30 mL的100 mL三角瓶中，采用篩選培養(yǎng)基，35 ℃，200 r/min，通氣恒溫振蕩培養(yǎng)36～72 h，并定期取發(fā)酵液檢測其產(chǎn)生乳酸的量及OD值，篩選出一株性能優(yōu)良的乳酸菌。將篩選到的乳酸菌接種于20 mL種子培養(yǎng)基，于35 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h；取出5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50 mL培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)16 h后轉(zhuǎn)接入250 mL種子培養(yǎng)基中。在35 ℃條件下，每隔2 h取樣，用0.85%的氯化鈉溶液稀釋20倍，并以各瓶離心去除菌體后稀釋相同倍數(shù)種子液作為空白對照，測定OD600值。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

對培養(yǎng)基中碳源、氮源及碳氮比進行了選擇及優(yōu)化。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖20.0 g，胰蛋白胨2.0 g，酵母膏10.0 g，牛肉膏3.0 g，無水乙酸鈉2.0 g， 檸檬酸三銨 2.0 g，K2HPO4·H2O 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnCl2·4H2O 0.06 g，NaCl 40 g，吐溫80 1 mL，酚紅5%，pH=9.0，去離子水1 L)的基礎(chǔ)上，分別以葡萄糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、木糖、果糖作為碳源，用量為2%；以酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硝酸銨、硫酸銨作為氮源，用量為0.5%。斜面菌種經(jīng)種子培養(yǎng)基活化16 h后，按5%接種量轉(zhuǎn)接入50 mL培養(yǎng)基中，于35 ℃、200 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，定期取樣品測定OD600值及乳酸的產(chǎn)量。對所選氮源調(diào)整用量分別為0.5%、1%、1.5%，確定最佳用量；對所選碳源、氮源的比值分別采用1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，確定最佳碳氮比。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

分別考察接種量、初始pH值、溫度、裝液量等條件對乳酸產(chǎn)量的影響，并進行優(yōu)化。接種量分別為1%、3%、5%、8%、10%，初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，采用35 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，定期取樣品測定OD600值及乳酸的產(chǎn)量；考察了培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40 ℃時菌株的發(fā)酵情況；調(diào)整250 mL三角瓶裝液量，分別為30、50、80、125 mL進行培養(yǎng)，同時對125 mL裝液量的菌體在培養(yǎng)時采用12 h好氧和整個培養(yǎng)期間全封閉式培養(yǎng)。

將菌種經(jīng)種子培養(yǎng)基活化16 h后，轉(zhuǎn)接入優(yōu)化后的培養(yǎng)基，采用優(yōu)化的條件發(fā)酵48 h，期間每隔2 h取樣檢測發(fā)酵液的OD600值、pH值和乳酸產(chǎn)生量，繪制菌株的生長曲線及產(chǎn)物生成曲線。

1.5 發(fā)酵液乳酸的毛細管電泳檢測

1.5.1 毛細管電泳的操作條件

P/ACE MDQ 毛細管電泳儀，熔融石英毛細柱(37 cm×50 μm I.D)。分離電壓，負電壓，8 kV；進樣壓力，3.4 kPa，時間6 s；柱溫，25 ℃；紫外檢測波長，200 nm；進樣量，100 μL。

1.5.2 毛細管電泳檢測方法

配制0.2～4.0 mg/mL系列乳酸標準溶液，在“1.5.1”所述電泳條件下依次進行分析，得到乳酸的標準曲線。在相同的電泳條件下測定發(fā)酵液中乳酸的含量。

將實際發(fā)酵液在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm針筒式水膜過濾器過濾，稀釋一定倍數(shù)后取樣100 μL進行檢測。每個樣品重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

出發(fā)菌株的初篩結(jié)果列于表1中。從表1可以看出，在14株菌中，289、SH1和LP3-3生長和產(chǎn)酸情況明顯好于其他菌株；其中SH1生長情況最好，LP3-3產(chǎn)酸最多。因此選擇289、SH1和LP3-3進行復(fù)篩。

表1 各株菌在篩選平板上的生長及產(chǎn)酸情況Tab.1 Growth and yield of acids at preliminary screening

289、SH1和LP3-3復(fù)篩結(jié)果見圖1。289、SH1和LP3-3 3菌株發(fā)酵24 h時乳酸產(chǎn)量相差不大；34 h時289、SH1兩株菌的乳酸產(chǎn)量基本沒有增長，而LP3-3的乳酸產(chǎn)量明顯高于其他兩株菌，說明LP3-3進入衰老期較晚，更易提高產(chǎn)酸量。因此選擇LP3-3作為出發(fā)菌株。

圖1 289、SH1和LP3-3三株菌復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Yield of acids at screening of 289, SH1 and LP3-3

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

通過考察培養(yǎng)基中碳源、氮源種類、濃度以及碳氮比對發(fā)酵過程乳酸產(chǎn)量的影響，確定葡萄糖為最佳碳源，酵母膏為氮源，添加質(zhì)量分數(shù)為0.2%的蛋白胨做輔助氮源，氮源質(zhì)量分數(shù)為1%，碳氮比為5∶1(見圖2～5)。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖50.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏10.0，蛋白胨 2.0，無水乙酸鈉2.0，檸檬酸三銨2.0，K2HPO4·H2O 2.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnCl2·4H2O 0.05，NaCl 40，吐溫80 1 mL。用10%的NaHCO3調(diào)節(jié)pH，初始pH為9.0。

G，葡萄糖； M，麥芽糖；St，淀粉；L，乳糖；X，木糖；F，果糖

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

接種量小于5%時，隨著接種量的增加，產(chǎn)生的乳酸量也相應(yīng)增加，但當接種量超過5%后，乳酸量反而下降，因此采用接種量為5%。隨著初始pH值的增加，菌體的生長速率逐漸變快，而初始pH 6～8時，菌體只有少量生長，且乳酸產(chǎn)量也較少；初始pH為9、10、11的發(fā)酵液中的乳酸量相對較多，其中pH=9時乳酸產(chǎn)量最高，因此選擇初始pH值為9。通過考察不同溫度時的發(fā)酵情況，確定35 ℃作為發(fā)酵溫度，種子培養(yǎng)溫度為30 ℃，發(fā)酵時用密封發(fā)酵較好，且宜采用125 mL裝液量250 mL搖瓶發(fā)酵。

U，尿素；N，硝酸銨；S，硫酸銨；Pr，蛋白胨；B，牛肉膏；Y，酵母膏

圖4 氮源質(zhì)量分數(shù)對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of concentration of nitrogen sources on lactic acid production

圖5 碳氮比對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of proportion of carbon and nitrogen on lactic acid production

利用最佳發(fā)酵條件和優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵42 h得到菌株生長曲線及產(chǎn)物生成曲線。從圖6看，0～4 h為延滯期，4～20 h為菌體的對數(shù)生長期，其后為穩(wěn)定期，直至42 h開始衰亡。菌體生長過程中伴隨乳酸的產(chǎn)生，在菌體數(shù)量達到穩(wěn)定，即20 h左右，乳酸仍然在緩慢增加，直至38 h左右達到峰值，說明菌體在先完成自身生長之后才開始大量積累乳酸，這與前面的結(jié)論是一致的。從圖7看，在0～24 h，pH值變化較大，隨著乳酸的增加pH值逐漸降低，但變化較緩，主要是由培養(yǎng)基中NaHCO3的緩沖作用引起的。從菌體生長情況也可看出該菌的生長pH值范圍較寬，但最適仍為9.0。

圖6 LP3-3菌株生長曲線Fig.6 Growth curve of LP3-3

圖7 產(chǎn)物生成及pH變化曲線Fig.7 Curve of pH and lactic acid production

2.4 毛細管電泳檢測結(jié)果

乳酸的線性范圍為0.2～4.0 mg/mL，峰面積(A)與質(zhì)量濃度(C)之間的線性關(guān)系為A=25 649C+1 147.2，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 4，檢出限為0.1 mg/mL，遷移時間相對標準偏差為0.24%，峰面積相對標準偏差為2.11%，樣品加標回收率為102.3%(n=4)，LP3-3菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸的測定結(jié)果如表2所示。

2.5 菌株的初步鑒定

對篩選到的菌株進行了初步鑒定，LP3-3經(jīng)16S rRNA序列測定初步鑒定為Exiguobacteriumaurantiacum。

表2 LP3-3菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸的測定結(jié)果Tab.2 Concentration of lactic acid produced by fermentation of LP3-3

3 結(jié) 論

從14株耐堿菌中篩選到一株LP3-3產(chǎn)乳酸能力較強，對該菌株進行乳酸發(fā)酵優(yōu)化后，確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成及搖瓶發(fā)酵最佳條件。采用毛細管電泳檢測發(fā)酵液中乳酸的含量， 出發(fā)菌株乳酸產(chǎn)量為10.02 g/L，在最佳發(fā)酵條件下乳酸產(chǎn)量為16.27 g/L，比原來提高62.4%，達到了較好的效果。本研究可為極端微生物在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸等生物基產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

[1] 劉偉雄. 乳酸和聚乳酸的最新進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2001, 27(3):61-65.

[2] DATTA R, TSAI S P, BONSIGNORE P, et al. Technological and economic potential of poly(lactic acid) and lactic acid derivatives[J]. FEMS Microbiology Reviews, 1995, 16: 221-231.

[3] 曹本昌,徐建林. L-乳酸研究綜述[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1993, 11(3):56-61.

[4] KARIN H, BARBEL H. Factors affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26: 87-107.

[5] 金其榮,張繼民,徐勤. 有機酸發(fā)酵工藝學(xué)[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,1989:339.

[6] KULOZIK U, WILDE J. Rapid lactic acid production at high cell concentrations in whey ultrafitrate by Lactobacillus helveticus[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1999, 24(5/6):297-302.

[7] 錢志良,胡軍,雷肇祖. 乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用和市場[J]. 工業(yè)微生物, 2001, 31(2):49-53.

[8] STILES M E, HOLZAPFEL W H. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy[J]. International Journal of Food and Microbiology, 1997, 36:1-29.

[9] SREENATH H K，MOLDES A B, KOEGEL R G, et al. Lactic acid production from agriculture residues[J]. Biotechnology Letters, 2001, 23:179-184.