銀杏外種皮多糖的超聲波輔助提取方法研究

牟 杰,婁 靖,吳加強(qiáng),湯道權(quán),支三軍

(1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,江蘇徐州 221000;2.淮陰師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,江蘇淮安 223300)

銀杏外種皮多糖的超聲波輔助提取方法研究

牟 杰1,婁 靖1,吳加強(qiáng)1,湯道權(quán)1,支三軍2

(1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,江蘇徐州 221000;2.淮陰師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,江蘇淮安 223300)

將超聲波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于提取銀杏外種皮多糖的研究,采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),得到最優(yōu)提取工藝.結(jié)果表明,對(duì)比傳統(tǒng)的直接加熱提取法,超聲波輔助提取能縮短提取時(shí)間,提高銀杏外種皮多糖得率.超聲波提取的最佳條件為:水浴溫度100℃,液料比(mL∶g)為10∶1.0,超聲提取時(shí)間40min,超聲波功率400W.在此工藝條件下,多糖得率為11.74%.

銀杏外種皮;多糖;超聲波輔助提取;含量分析

0 引言

銀杏(Ginkgo biloba L)又名白果,是現(xiàn)存種子植物中最古老的孑遺植物,有重要的研究和利用價(jià)值[1-2].我國(guó)銀杏種核產(chǎn)量占世界的90%以上,并保持8.0%～10.0%的年遞增,銀杏的核用栽培已發(fā)展成為我國(guó)銀杏產(chǎn)區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè).在每年生產(chǎn)1200～1400萬(wàn)公斤種核的同時(shí),約有3600～4200萬(wàn)公斤的銀杏外種皮遭到廢棄,浪費(fèi)銀杏資源的同時(shí)對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[3-5].因此,研究銀杏外種皮的綜合開(kāi)發(fā)利用顯得尤為迫切.

近年來(lái)的研究表明,銀杏外種皮中含有大量多糖類(lèi)化合物,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明銀杏外種皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides,GBEP)具有殺死腫瘤細(xì)胞、增加SOD的形成,提高機(jī)體免疫細(xì)胞活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用[6-10].提取銀杏外種皮多糖作為藥品或保健品,具有相當(dāng)好的市場(chǎng)前景.由于人們把精力都集中在銀杏中黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究上,對(duì)銀杏外種皮多糖的研究目前報(bào)道甚少,又由于多糖提取過(guò)程復(fù)雜、提取率不高、所得多糖純度低、活性相差較大等問(wèn)題的存在,使得這一領(lǐng)域的研究未能深入展開(kāi).

本文將超聲波技術(shù)應(yīng)用于銀杏外種皮多糖類(lèi)化合物的提取,對(duì)比傳統(tǒng)的熱水提取工藝有明顯優(yōu)勢(shì),對(duì)銀杏外種皮的綜合利用開(kāi)發(fā)具有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

材料:銀杏外種皮產(chǎn)自江蘇邳州.

試劑:無(wú)水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

儀器:AE240型電子天平、索式提取器、恒溫水浴鍋、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、TGL-16B型臺(tái)式低速離心機(jī)、5417R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、B-260型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DZF-6020S型真空干燥箱、vis-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì).

1.2 銀杏外種皮多糖提取工藝

1.2.1 提取步驟

將銀杏外種皮于60℃烘干并粉碎→超聲波浸提→離心→上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→95%乙醇沉淀上清液→靜置過(guò)夜,取沉淀物→洗滌→分離→真空干燥→分析檢測(cè).

1.2.2 超聲波提取法

稱(chēng)取粉碎后的銀杏外種皮20 g(干物質(zhì)),置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)內(nèi),在選定的超聲功率、液固比、提取時(shí)間和溫度條件下,超聲提取,過(guò)濾,得濾液.將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮為原體積的1/4后,緩緩加入濃縮液5倍體積的95%乙醇,離心,收集多糖沉淀,沉淀復(fù)溶于水中,再次用5倍體積的95%乙醇沉淀,離心,沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌,真空干燥得多糖粗品.

1.3 多糖含量的測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸法[11]測(cè)定提取液中多糖含量.

1.3.1 體積分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液的配制

取苯酚12.5 g,置250mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,避光,冷藏.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20mg,用100mL雙蒸水定容,得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.將該標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度分別為30,60,90,120,150和180μg/mL的溶液,分別吸取稀釋液0.6mL,加入5%苯酚1.2mL、濃硫酸4mL,混合均勻后,30℃顯色20min,在486 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[11],空白對(duì)照以雙蒸水代替糖溶液,以葡萄糖濃度(c)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1.

1.3.3 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的粗多糖(W)5份分別定容至10mL,吸

取樣品液0.6mL,按上述步驟操作,分別測(cè)定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得多糖的平均含量.

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中:c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的濃度(μg/mL),W為多糖樣品的質(zhì)量(mg)

1.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

用硫酸-苯酚法測(cè)定同一樣品液在不同時(shí)間的吸收度,結(jié)果表明吸光度(A)在24 h內(nèi)不變.

1.3.5 回收率測(cè)定

稱(chēng)取自制銀杏外種皮多糖適量,加入精制銀杏外種皮多糖適量,按樣品液制備和多糖含量測(cè)定方法操作,測(cè)得多糖平均回收率為99.23%,RSD=1.2%,n=5.

1.4 超聲波輔助提取多糖的單因素考察

影響超聲波提取的因素主要有超聲波處理時(shí)間、超聲波功率、液料比和水浴溫度.稱(chēng)取5 g銀杏外種皮,加入50mL水(即液料比10∶1.0),經(jīng)400W的超聲波處理40min,90℃水浴提取.在其他條件不變的情況下,改變其中一個(gè)因素探討對(duì)多糖得率的影響.

1.5 超聲波法提取條件的優(yōu)化

在單因素考察的基礎(chǔ)上,用正交試驗(yàn)對(duì)影響提取的因素:超聲波處理時(shí)間、功率、液料比及水浴溫度進(jìn)行優(yōu)化.不考慮各因素間的交互影響,選用正交表L9(34).

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輔助提取多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

以超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖提取率作曲線,結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖可以看出,隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率逐漸升高.超聲波處理40min時(shí),得率最高,可達(dá)到10.81%.而后,隨著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率開(kāi)始下降.這是由于超聲波的機(jī)械剪切作用,長(zhǎng)時(shí)間加熱使大分子多糖斷裂而損失.

2.1.2 液料比對(duì)多糖提取率的影響

以液料比對(duì)多糖提取率作曲線,結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖可以看出,液料比為10∶1.0(mL∶g)時(shí),多糖得率最高,可達(dá)到11.74%.隨著液料比的增加,得率開(kāi)始下降.

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

圖2 超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.1.3 超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響

以超聲波功率對(duì)多糖提取率作曲線,結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖可以看出,隨著超聲波功率的增加,多糖得率逐漸升高.功率為400W時(shí),得率最高,可達(dá)到11.13%.隨著功率的增加,多糖得率開(kāi)始下降.輸出功率和頻率決定了超聲波場(chǎng)的強(qiáng)度,這表明增加超聲波強(qiáng)度可加快水的循環(huán)速度,強(qiáng)化傳質(zhì),同時(shí)使細(xì)胞的破碎程度增加,有利于多糖的提取.

2.1.4 水浴溫度對(duì)多糖提取率的影響

以水浴溫度對(duì)多糖提取率作曲線,結(jié)果見(jiàn)圖5.由圖可以看出,溫度為100℃時(shí)多糖得率達(dá)到11.88%.

圖4 超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響

圖5 水浴溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2 超聲波法提取多糖條件的優(yōu)化

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了直觀分析,結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可以看出,4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響為A>C>B>D,依次為:水浴溫度>液料比>超聲波時(shí)間>功率.最佳工藝組合為A1B2C2D3,即溫度為100℃,時(shí)間為40min,液料比為10∶1.0(mL∶g),功率為400W.在此條件下,取20 g銀杏外種皮粉進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),多糖得率為11.74%.

表1 超聲波法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 超聲波輔助提取法和熱水浸提法的比較

熱水浸提法:稱(chēng)取20 g銀杏外種皮粉末,加入750mL水,液料比15∶1,100℃水浴提取120min,測(cè)得多糖得率為5.92%.超聲波提取與熱水浸提法的結(jié)果比較見(jiàn)表2.

表2 超聲波輔助提取法和熱水浸提法的比較

實(shí)驗(yàn)表明,超聲波提取法明顯縮短了提取周期,減少了溶劑用量,在多糖提取率方面也有明顯提高.這是因?yàn)槌暡ㄌ幚砜赡苁挂徊糠职诮Y(jié)構(gòu)未受到根本性破壞,而僅發(fā)生變形和裂紋,而在后來(lái)的水提過(guò)程中,進(jìn)一步破壞胞壁結(jié)構(gòu),熱效應(yīng)使分子的熱運(yùn)動(dòng)加速,從而導(dǎo)致銀杏外種皮中水溶性多糖得到更充分的釋放.

3 結(jié)論

本文以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),結(jié)合生產(chǎn)成本和現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件,對(duì)銀杏外種皮多糖的提取進(jìn)行了超聲波輔助的改進(jìn),并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析討論,得到如下結(jié)論:

1)超聲波提取具有節(jié)省時(shí)間、降低能量消耗等優(yōu)點(diǎn),而且可以明顯提高多糖的得率,是提取銀杏外種皮多糖的一個(gè)可行的方法.

2)在水浴溫度、液料比、超聲波處理時(shí)間及功率等4個(gè)考察因素中,水浴溫度的影響最大.50 g銀杏外種皮粉超聲波提取的最佳工藝條件為:水浴溫度100℃,液料比(mL∶g)為10∶1.0,時(shí)間40min,功率400W,多糖的得率為11.74%.

[1] 郭善基.中國(guó)果樹(shù)志:銀杏卷[M].中國(guó)林業(yè)出版社,1999.

[2] 陳鵬.銀杏產(chǎn)業(yè)提升和可持續(xù)發(fā)展[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2002.

[3] 陳鵬.銀杏的綜合開(kāi)發(fā)利用[M].江蘇林業(yè)科技,1992.

[4] 陳鵬.經(jīng)濟(jì)全球化中銀杏發(fā)展的戰(zhàn)略與對(duì)策[M].//東南大學(xué)全國(guó)第九次銀杏學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.南京:東南大學(xué)出版社,2001.

[5] 梁立興.銀杏外種皮的研究現(xiàn)狀與開(kāi)發(fā)利用前景[J].中國(guó)資源綜合利用,2003(10):12-14.

[6] 許愛(ài)華,陳鵬.銀杏藥理學(xué)研究與開(kāi)發(fā)技術(shù)[M].鄭州:鄭州大學(xué)出版社,2003.

[7] Xu A H,Chen H S,Sun B C,et al.Therapeuticmechanism of Ginkgo b0iloba exocarp polysaccharideson gastric cancers[J].World J Gastroenterol,2003,9(11):2424-2427.

[8] 翟范,陳華圣.銀杏外種皮多糖制劑治療中晚期癌癥84例[J].遼寧中醫(yī)雜志,2002,29(9):564-572.

[9] 許愛(ài)華,陳華圣,陳鋼,等.銀杏外種皮多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞p53基因的表達(dá)及端粒酶活性的影響 [J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003,19(10):1174-1176.

[10] 陳華圣,許愛(ài)華,王翊.銀杏外種皮多糖對(duì)免疫功能低下小鼠IL-2活性及sIL-2R的影響[J].中藥藥理與臨床,2002,17(4):17-19.

[11] 茆廣華,吳向陽(yáng),仰榴青,等.苯酚-硫酸法測(cè)定銀杏外種皮多糖的含量 [J].食品科技,2008(6):217-220.

Abstract:The ultrasond-assisted extraction technology for polysaccharide in Gingko biloba exocarp was studied in this paper,by using single factor experiment and orthogonalmethod.The conditions of the factorswere extraction temperature 100℃,extraction time 40min,ratio of extraction solvent to material 10∶1.0,ultrasonic power 400W.Under this condition,the yield of polysaccharides is 11.74%.Compared with direct-heating extraction,ultrasonic extraction can shorten the extracting time,and improve yield of ginkgo biloba polysaccharides.

Key words:gingko biloba exocarp;polysaccharide;ultrasonic assisted extraction

[責(zé)任編輯:蔣海龍]

Ultrasound-assisted Extraction of
Polysaccharides in Ginkgo Biloba Exocarp

MOU Jie1,LOU Jing1,WU Jia-qiang1,TANGDao-quan1,ZHISan-jun2

(1.Pharmacy of Xuzhou Medical College,Xuzhou Jangsu 221000,China)(2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Huaiyin Normal University,Huaian Jangsu 223300,China)

O629.12

A

1671-6876(2010)06-0507-05

2010-06-06

牟杰(1974-),女,江蘇徐州人,副教授,博士,主要從事藥物合成研究.