大黃對急性胰腺炎T淋巴細(xì)胞亞群的改變的影響

姜良富

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是腹部外科常見病，其中，急性重癥胰腺炎(Acute sever pancreatitis，SAP)起病急驟，病情兇險，最近的研究提示，免疫異常在AP的病情惡化中起著關(guān)鍵作用。越來越多的學(xué)者認(rèn)為AP的發(fā)病和免疫異常有關(guān)，Liras等[1]觀察到重癥胰腺炎病人巨噬細(xì)胞吞噬功能尤其低下，實(shí)驗(yàn)表明單核巨噬系統(tǒng)的預(yù)激和激活是AP免疫紊亂發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，有關(guān)AP患者的免疫功能變化很復(fù)雜，目前針對這一領(lǐng)域的研究不多，與AP的關(guān)系尚不明了，本研究采用Wistar大鼠經(jīng)胰管逆行注入5%牛磺膽酸鈉溶液復(fù)制SAP模型，用流式細(xì)胞儀檢測AP大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化，并進(jìn)行大黃的實(shí)驗(yàn)治療學(xué)研究，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

將健康Wistar大鼠20只隨機(jī)分為二組：SAP模型組(M組，n=10)和SAP大黃治療組(T組，n=10)，所有動物術(shù)前禁食12小時，禁水6小時，3%戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射(30mg/kg)麻醉，麻醉成功后固定四肢，腹部備皮，碘酒，酒精消毒切口后鋪巾，按外科無菌要求手術(shù)，采用上腹壁正中切口入腹，尋及十二指腸及胰膽管，用一小動脈夾夾閉膽管近肝端，1號絲線結(jié)扎胰膽管近腸端，并用41/2#皮試針頭刺入胰膽管腸端，M組以0.2ml/min的速度向胰膽管內(nèi)逆行推注5%?；悄懰徕c溶液(0.1ml/100g)，推注過程中即見胰腺出血，水腫，注畢壓迫腸端5分鐘后見胰腺明顯出血壞死后去除小動脈夾及絲線；T組按M組方式復(fù)制SAP模型，關(guān)腹后即刻給以大黃素溶液1ml(5mgl/100g)胃內(nèi)注射，M組動物手術(shù)后給以生理鹽水1ml胃內(nèi)注射，術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由飲水，術(shù)后24小時，M組和T組大鼠予以3%戊巴比妥鈉溶液(10～20mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌條件下行頸動脈插管，抽血3ml作細(xì)菌培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀檢測，并在無菌條件下剖腹切取胰腺及腸系膜淋巴結(jié)作細(xì)菌培養(yǎng)，取相同部位的胰腺及回腸組織作光鏡檢查。

1.2 觀察項(xiàng)目

1.2.1 一般狀況

觀察術(shù)后動物精神狀態(tài)，活動反應(yīng)，飲水，毛是否光順等情況。

1.2.2 腹水

第二次開腹后觀察腹水顏色并記錄量；

T淋巴細(xì)胞亞群檢測方法:采血樣1.8ml，加預(yù)先配置的肝素抗凝劑0.2ml混勻，取專用試管2支，各管依次加入CD4-FICT及CD8-FICT單克隆抗體各20μl及肝素抗凝血100μl，充分混勻，置室溫避光保存20分鐘后每管加入溶血劑2ml充分混勻，避光保存10分鐘，2000r/min，離心5分鐘，棄上清；用PBS洗滌三遍，加入PBS0.5ml，樣本在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按完全對照設(shè)計(jì)的要求收集，整理，建立數(shù)據(jù)庫，采用spss11.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析(F檢驗(yàn))。

表1 二組動物腹水量的變化(±s)

表1 二組動物腹水量的變化(±s)

注:T與M組比較P＜0.01。

組別 n 腹水量(ml)M 10 10.18±2.50 T 10 3.79±1.17

表2 二組動物血中CD4+/CD8+濃度以及CD4+/CD8+的變化(±s)

表2 二組動物血中CD4+/CD8+濃度以及CD4+/CD8+的變化(±s)

注:△與M組比較，P＜0.05；△*與*比較P＞0.05。

組別 n CD4+ CD8+ CD4+/CD8+M 10 32.30±7.21# 51.45±7.13 0.64±0.12*T 10 38.42±4.55△ 43.35±11.77 0.95±0.24△*

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況

大鼠蘇醒后，M組大鼠精神萎靡,卷屈,不愿活動，有的不能站立，反應(yīng)差，全身肌張力低，不愿飲水,T組大鼠精神狀態(tài)較M組好。

2.2 腹腔內(nèi)臟器大體病理變化

M組第二次開腹麻醉藥僅需正常劑量的1/3～1/2，剖腹后見胃和腸壁極度擴(kuò)張，積液積氣明顯，腸管呈暗紅和紫紅色，大網(wǎng)膜及腸系膜上可見廣泛皂化斑，胰腺水腫明顯，呈暗紅色，并可見大面積的出血，壞死灶，T組一般情況較M組為輕，胃腸輕度擴(kuò)張，積液積氣較少，胰腺輕度腫脹，可見散在小面積的出血，壞死灶，第二次麻醉藥亦僅需正常劑量的1/3～1/2，腹腔內(nèi)皂化斑減少，呈零星散在狀。

2.3 腹水情況

M組動物腹腔內(nèi)有大量腹水，渾濁，為黃色和血性積液，T組腹腔內(nèi)僅見少量和中等量腹水，且多為淡黃色，從表1中可見，M組，T組動物的腹水量均升高；T組動物的腹水量較M組明顯下降(P＜0.01)。

2.4 血中CD4+/CD8+陽性細(xì)胞數(shù)以及CD4+/CD8+變化

用FCM測定各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)M組大鼠血中CD4+陽性細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+的值明顯下降，顯著低于T組(P＜0.05)；二組間CD8+陽性細(xì)胞數(shù)比較無明顯差異(P＞0.05)。詳見表2。

3 討論

AP的啟動及病情演變機(jī)制十分復(fù)雜，除胰酶激活自身消化胰腺的損傷機(jī)理外，粒細(xì)胞過度激活，細(xì)胞因子的“瀑布反應(yīng)”及胰管壓力過高等均參與了AP的發(fā)生與發(fā)展的過程[2]。抑制胰腺外分泌和降低酶活性的傳統(tǒng)治療并未顯著改變AP的預(yù)后，最近的研究提示，免疫異常在AP的病情惡化中起著關(guān)鍵作用，越來越多的學(xué)者認(rèn)為AP的發(fā)病和免疫異常有關(guān)，因此從免疫學(xué)角度探討AP的發(fā)病機(jī)制，尋求免疫療法阻止AP的病情發(fā)展是當(dāng)今外科值得研究的課題。

3.1 急性胰腺炎與免疫

自20世紀(jì)90年代以來，人們對急性胰腺炎病程中的免疫異常進(jìn)行了大量的研究，但研究的重點(diǎn)主要集在炎癥過激反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子的病理損害和相應(yīng)治療方面，而對機(jī)體細(xì)胞免疫功能研究甚少[3-4]，在感染和損傷的動物模型和臨床研究中已經(jīng)觀察到，在全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)中的發(fā)展過程中，隨著炎癥介質(zhì)的大量釋放，抗炎癥因子的合成與釋放也相應(yīng)啟動，并在SIRS后期成為優(yōu)勢效應(yīng)，這些抗炎因子在抑制炎癥反應(yīng)的同時也抑制機(jī)體對病原體的免疫作用，特別是抑制細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)[5]，新近研究表明，重癥急性胰腺炎是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，因此它可能存在著細(xì)胞免疫功能的紊亂。

本實(shí)驗(yàn)參照Lankisch等[6]的方法并進(jìn)行改良，復(fù)制大鼠的SAP模型，復(fù)制模型24小時后，M組可見胰腺明顯水腫，呈灰褐色，胰頭周圍及腸系膜可見皂化斑形成，鏡下可見胰腺有大片出血，壞死灶，紅細(xì)胞外滲成團(tuán)，間質(zhì)，導(dǎo)管，動脈內(nèi)及管周大量中性粒細(xì)胞浸潤，部分有小膿腫形成；胰腺腺泡水腫呈角狀，這些都極似臨床上的SAP[7-8]，流式細(xì)胞儀檢測M組動物血CD4+陽性細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+的值明顯降低，相反，SO組動物反應(yīng)較好，胰腺無水腫，出血及壞死，無腹水及胰周皂化斑，胃腸不積液積氣和擴(kuò)張，血CD4+陽性細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+的值明顯高于M組，T淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要因素，體內(nèi)通過輔助性T細(xì)胞CD4+和抑制性T細(xì)胞CD8+形成的T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)來維持調(diào)節(jié)免疫功能的平衡[9]，二者的升高與降低，均可使兩者的比例失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異?；蛭蓙y[10]。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩者通過直接作用和其分泌的細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)控和維持免疫穩(wěn)定方面具有重要作用，CD4+T細(xì)胞為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞(Th/Ti)，Ti細(xì)胞成熟誘導(dǎo)Th，TS細(xì)胞的成熟，這類細(xì)胞在細(xì)胞免疫的效應(yīng)階段能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而加速消除抗原物質(zhì)，CD8+細(xì)胞可對靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，即直接殺傷帶有特異性抗原的細(xì)胞或相應(yīng)的靶細(xì)胞，對CD4+細(xì)胞具有調(diào)節(jié)性抑制作用，燒傷，創(chuàng)傷及輸入內(nèi)毒素后均能引起CD4+T細(xì)胞比例降低，出現(xiàn)相應(yīng)的免疫缺陷癥狀，并與燒傷、創(chuàng)傷膿毒癥發(fā)生相關(guān)的遲發(fā)性皮膚高敏反應(yīng)有關(guān)，反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞免疫功能的降低[11-12]，因此CD4+細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+的值可部分反映SAP病人的細(xì)胞免疫功能，許多學(xué)者認(rèn)為SAP病人細(xì)胞免疫功能減退，這是SAP感染并發(fā)癥和死亡率的重要原因，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，M組CD4陽性細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+的比值均較正常對照組明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異，CD4+T細(xì)胞一方面可分泌IL-2，它可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌IL-1，另一方面可使靜止的T細(xì)胞表達(dá)IL-2受體，后者與IL-2結(jié)合，引起不同的免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致淋巴細(xì)胞DNA合成增強(qiáng)，所以CD4+T細(xì)胞減少勢必影響機(jī)體的免疫功能，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力降低，同時發(fā)現(xiàn)M組CD8陽性細(xì)胞百分比沒有下降，與正常組相比無顯著差異，以上結(jié)果表明SAP時，不僅胰腺炎癥改變嚴(yán)重，而且還存在明顯的細(xì)胞免疫功能抑制，其主要原因是SAP病程中組胺、緩激肽和許多細(xì)胞因子的變化對免疫系統(tǒng)具有抑制作用，引起CD4陽性細(xì)胞百分比下降明顯，CD8陽性細(xì)胞百分比正常，從而加重CD8細(xì)胞對CD4細(xì)胞的抑制作用，并導(dǎo)致CD4+/CD8+的比值降低，引起細(xì)胞免疫功能的嚴(yán)重破壞。

3.2 大黃對急性胰腺炎的治療研究

祖國醫(yī)學(xué)本著六腑以通為用的基本理論，采用大黃等瀉下藥物治療急性胰腺炎，取得了顯著的臨床治療效果[13]，但其確切機(jī)理仍不清楚，現(xiàn)代研究認(rèn)為:大黃具有改善微循環(huán)，改善腸麻痹，降低炎性介質(zhì)，抑制腸菌及清理腸道等作用，高雅萍[14]認(rèn)為大黃具有抑制胰蛋白酶，胰脂肪酶的活性和釋放的作用，對胰腺細(xì)胞膜有保護(hù)作用，使胰酶及降解產(chǎn)物不能侵入細(xì)胞，對內(nèi)毒素性發(fā)熱及腸道內(nèi)毒素有明顯的抑制作用，能顯著地降低血漿內(nèi)毒素水平，同時發(fā)現(xiàn)大黃能保護(hù)腸粘膜屏障，清除氧自由基，對多臟器損傷有保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大黃治療后的T組動物精神狀態(tài)等一般情況較M組好，胰腺水腫，出血及中性粒細(xì)胞浸潤較M組明顯減輕，鏡下腺泡水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤減輕，僅有點(diǎn)灶狀壞死出血灶，無小膿腫形成；回腸粘膜間質(zhì)水腫，淋巴管擴(kuò)張及中性粒細(xì)胞浸潤較M組減輕，絨毛基本完整無水腫，M組動物腹腔內(nèi)有大量腹水，渾濁，為黃色和血性積液，經(jīng)大黃治療后的T組腹腔內(nèi)僅見少量和中等量腹水，腹水量較M組明顯下降，且多為淡黃色，以上結(jié)果表明，大黃對SAP確實(shí)有一定的治療作用，它具有保護(hù)胃腸黏膜屏障，抑制細(xì)胞因子的分泌，阻止重癥感染患者的病程向多臟器功能衰竭演變的重要作用[15]，T組動物胰腺病變較輕，說明大黃還可使病態(tài)胰腺細(xì)胞之間的緊密連接處恢復(fù)正常，對胰腺細(xì)胞具有保護(hù)作用，同時T組血CD4+陽性細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+的值明顯高于M組，而血及臟器細(xì)菌培養(yǎng)陽性率明顯低于M組，血CD4+陽性細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+的比值增高可增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，糾正免疫紊亂，同時促進(jìn)B細(xì)胞的活化與分化，增強(qiáng)體液免疫，以上結(jié)果表明大黃可以通過升高SAP動物血CD4+陽性細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+的值，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能阻止SAP的病程發(fā)展。

本研究結(jié)果表明，病程早期采取有效的措施防止機(jī)體免疫紊亂提高免疫功能，是預(yù)防和治療SAP后繼發(fā)感染的重要原則，應(yīng)用中藥大黃從免疫的角度治療SAP值得我們進(jìn)一步的研究。

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