電針腧穴“胃病方”對急性胃黏膜損傷模型大鼠延髓和下丘腦c-fos表達(dá)的影響

閆麗萍，冀來喜，王海軍 ，王 博，張夏毅，張?zhí)焐?，金曉飛

（1.山西中醫(yī)學(xué)院針灸系，山西 太原 030024； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸系，湖北 武漢 430061；3.山西省針灸研究所實驗中心，山西 太原 030006）

c-fos癌基因在細(xì)胞的靜息狀態(tài)下只有低水平的表達(dá)，因此細(xì)胞核內(nèi)的c-fos樣免疫反應(yīng)陽性（cfos like immunoreactivity，c-FLI）表示神經(jīng)元被激活。由于c-FLI表達(dá)具有敏感性、快速性、短暫性的特點，所以檢測神經(jīng)組織細(xì)胞核內(nèi)的c-fos可以從單細(xì)胞水平上觀察神經(jīng)元的活動情況，從而得以追蹤生理或藥理刺激發(fā)揮作用的神經(jīng)傳導(dǎo)通路［1］。而且當(dāng)機(jī)體受到某種刺激時，在該刺激信息向中樞傳導(dǎo)的神經(jīng)通路上，多數(shù)神經(jīng)元均會出現(xiàn)fos蛋白陽性表達(dá)［2］。本實驗從免疫組化的角度觀察了電針腧穴“胃病方”對急性胃黏膜損傷大鼠延髓及下丘腦cfos蛋白表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠40只（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物編號：0071678），雌雄各半，體重（200±25）g。在中國輻射研究院實驗動物中心（清潔級實驗室）檢疫并適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d，動物飼養(yǎng)室溫度、采光、通風(fēng)良好。用消毒的顆粒型大鼠飼料和自來水喂養(yǎng)，自由攝取。

1.1.2 藥品與試劑 10%烏拉坦、無水乙醇、c-fos抗體及免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模 40只wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、假模型組、模型組及胃病方組4組，每組10只。所有動物在實驗當(dāng)天的同一時間取出，捉拿動物時盡可能動作輕柔。在實驗過程中，將動物置于柔軟的實驗臺上，保持室溫恒定和周圍環(huán)境安靜，避免不必要的刺激，以避免c-fos的假陽性表達(dá)。各組動物實驗前24 h禁食，自由進(jìn)水，實驗2 h前禁水。空白組大鼠不做任何處理；假模型組大鼠2 h后灌入生理鹽水1 mL，不作治療，10%烏拉坦（10 mL/kg體重）腹腔注射麻醉大鼠后取材檢測；模型組2 h后灌入無水乙醇1 mL，不作治療，10%烏拉坦（10 mL/kg體重）腹腔注射麻醉大鼠后取材檢測；胃病方組2 h后灌入無水乙醇1 mL，電針“胃病方”，10%烏拉坦（10 mL/kg體重）腹腔注射麻醉取材檢測。

1.2.2 針刺方法 造模60 min后對胃病方組進(jìn)行治療，穴位取足三里、內(nèi)關(guān)、中脘。穴位的定位：內(nèi)關(guān)，前肢內(nèi)側(cè)，離鼠腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間；后（足）三里，膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處［3］；中脘，在大鼠的腹正中線上，以劍突為一定位點，以恥骨聯(lián)合上緣為另一定位點，兩者連線的上1/3段與下2/3段的交點［4］。1 mL無水乙醇灌胃1 h后即毫針垂直刺入大鼠以上穴位約5 mm，再在每個穴位旁開0.01寸（非穴位）刺入另外一根毫針，并以G6805-1型電針儀進(jìn)行治療，其中電針儀的一個負(fù)極連接穴位上的毫針，同一插口的正極接非穴位上的毫針。施以疏密波，頻率10 Hz～30 Hz，電流強(qiáng)度以大鼠肢體微顫為宜。電針20 min，1 h后取材。

1.2.3 標(biāo)本制作與免疫組化 電針治療后，10%烏拉坦按1 mL/100 g體重麻醉大鼠，開胸暴露心臟，經(jīng)心臟和升主動脈快速灌入生理鹽水約200 mL至肝臟發(fā)白，然后經(jīng)心臟灌注含4%多聚甲醛約200 mL至大鼠的身體發(fā)硬即可。再剝離下丘腦與延髓，置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后，連續(xù)冠狀切片，片厚 40 μm。

免疫組化SABC法按照試劑盒提供的方法操作。切片漂洗后裱片，晾干、脫水、透明、封固，光鏡下觀察并攝片。fos陽性細(xì)胞計數(shù)分別選擇NTS和DMV （dm-nx）。每只大鼠隨機(jī)選擇一套延髓片，在10（目鏡）×10（物鏡）倍率下，計算該套切片中延髓和下丘腦中fos陽性細(xì)胞的總和，而后在每組動物間取均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

對照實驗（PBS代替一抗）為陰性?？瞻捉M大鼠延髓和下丘腦部c-fos陽性細(xì)胞有少量表達(dá)，而胃黏膜損傷后延髓和下丘腦中c-fos陽性細(xì)胞個數(shù)增多，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，經(jīng)電針胃病方治療后延髓和下丘腦中cfos陽性細(xì)胞個數(shù)明顯增多（P<0.05）。結(jié)果見表1，圖1、圖 2。

表1 各組大鼠c-fos蛋白在延髓和下丘腦表達(dá)的比較 （±s）

表1 各組大鼠c-fos蛋白在延髓和下丘腦表達(dá)的比較 （±s）

注：與空白組比較，1）P<0.05；與模型組比較，2）P<0.05

下丘腦部fos陽性細(xì)胞數(shù)（個）空白組 10 5.86±1.56 5.71±2.26假模型組 10 6.03±1.68 7.89±3.04模型組 10 32.72±3.831） 25.36±6.681）胃病方組 10 46.59±4.121）2） 37.58±3.711）2）組別 n 延髓部fos陽性細(xì)胞數(shù)（個）

圖1 各組大鼠大鼠c-fos蛋白在延髓表達(dá)圖

圖2 各組大鼠大鼠c-fos蛋白在下丘腦表達(dá)圖

3 討 論

c-fos蛋白是c-fos癌基因（它是反轉(zhuǎn)錄病毒vfos癌基因的同源序列，是即早基因 ［（Immediateearly gene）家族中的一員］的表達(dá)產(chǎn)物，同時它是一種核內(nèi)的磷蛋白，在胞漿內(nèi)翻譯后經(jīng)修飾迅速進(jìn)入核內(nèi)，與DIAL結(jié)合發(fā)揮其對靶基因（target gene）的調(diào)控作用。c-fos表達(dá)可能是神經(jīng)元被刺激激活的一種標(biāo)志，可用以分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元受到外周刺激后的活動變化［5］。

存在于正常細(xì)胞內(nèi)的c-fos原癌基因所編碼的fos蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)中起重要作用，它被認(rèn)為是一種第三信使調(diào)控靶基因的表達(dá)［6］。c-fos作為第三信使在功能性胃腸疾病的發(fā)病機(jī)制研究中提供了可靠而快捷的方法［7-8］。當(dāng)機(jī)體受到刺激時，興奮性信息通過神經(jīng)通路傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，許多神經(jīng)元中c-fos蛋白呈陽性表達(dá)，這一結(jié)果不僅已在形態(tài)學(xué)上得到證實，而且還具有一定程度的功能意義［9-10］。

針灸的效應(yīng)與其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響有著密切的關(guān)系，而通過c-fos表達(dá)，我們可以比較清楚地了解針灸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。王成夭等［11］運用RNA斑點雜交方法比較了電針足三里穴與福爾馬林注射于足掌皮下對大鼠c-fos mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明電針和福爾馬林刺激后均可誘發(fā)cfos mRNA表達(dá)增強(qiáng)，嗎啡能明顯抑制福爾馬林誘導(dǎo)c-fos mRNA表達(dá)，而對電針誘導(dǎo)的c-fos mRNA表達(dá)無明顯影響，提示兩種刺激的傳入途徑不同，電針不等同于傷害性刺激。展淑琴等［12］研究發(fā)現(xiàn)電針針刺大鼠足三里可引起其腦內(nèi)下丘腦室旁核、下丘腦室周核和視上核c-fos的表達(dá)，表明電針引起了這些部位神經(jīng)元活性的變化，在實驗中也有類似的發(fā)現(xiàn)。

盡管人們通過c-fos技術(shù)對單穴在中樞的神經(jīng)通路做了大量的研究，但多穴的中樞通路尚未見報道?；谏鲜鲈?，本實驗從免疫組化的角度觀察了電針腧穴“胃病方”對急性胃黏膜損傷大鼠延髓及下丘腦c-fos蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃黏膜損傷后延髓和下丘腦中c-fos陽性細(xì)胞個數(shù)增多，與模型組相比，經(jīng)電針胃病方治療后延髓和下丘腦中c-fos陽性細(xì)胞個數(shù)明顯增多。同時參照大鼠腦圖譜，c-fos陽性細(xì)胞在延髓的孤束核、三叉神經(jīng)背核及背側(cè)網(wǎng)狀亞核等核團(tuán)和下丘腦背外側(cè)區(qū)表達(dá)較多。孤束核、三叉神經(jīng)背核是內(nèi)臟感覺神經(jīng)纖維的傳入部位，背側(cè)網(wǎng)狀亞核與痛覺傳導(dǎo)相關(guān)，它們與下丘腦都有直接或間接的神經(jīng)纖維投射。但以上部位是否為三個穴位共同作用部位不是很明確，仍需進(jìn)一步證實。

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