酶-超聲波輔助提取藍莓果渣中花青素的工藝研究

趙爾豐，高 暢，高 欣，程大海

（哈爾濱市第三中學(xué)，哈爾濱 150001）

藍莓（Vaccinium vitisidaea）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp）多年生落葉或常綠灌木。藍莓原產(chǎn)北美洲，是地球上少有的真正藍色食物之一。藍莓果實集營養(yǎng)保健于一身，果皮中富含的活性物質(zhì)—花青素，具有很強的抗氧化、抗腫瘤、增強心血管功能等作用[1-3]。此外，藍莓花青素對改善人的弱視具有專一的功效[4－5]。藍莓適于鮮食，更適于加工成果汁飲料、果酒飲品等[4-6]。據(jù)報道只有13%～23%的花青素在于巴氏殺菌的藍莓果汁中，而大約42%存留在果渣中[7]；我國的藍莓商品化主要為初級加工產(chǎn)品，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的廢棄果渣[8]。因此，為了更加充分利用藍莓花青素資源，有必要對藍莓果渣中花青素的提取工藝進行研究，從而獲得一種高效、節(jié)能、安全的藍莓果渣中花青素提取方法。

目前，藍莓中花青素的提取方法有水提取、有機溶劑提取、超臨界流體提取和酶輔助提取等方法。水提法成本低，但提取率差，原料利用率不高，資源浪費嚴重；有機溶劑易對環(huán)境及操作者產(chǎn)生危害；超臨界流體法雖提取率高，但因設(shè)備昂貴，普及受限制[9-10]。已經(jīng)報道的酶輔助提取方法較多，但多在強酸性條件下實施，對于藍莓資源深入應(yīng)用有極大的制約。為此，本研究以超聲波為動力，利用酶解方法提取藍莓果渣中花青素。本法操作簡便，提取效率高，為藍莓資源充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

藍莓購自大興安嶺地區(qū)加格達奇市。

1.2 儀器與試劑

多功能勻漿機，SHIMADZU UV-2550型紫外可見分光光度儀，電子天平，DK-9821電子恒溫水浴鍋，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴槽。

纖維素酶（30 U·mg-1）、果膠酶（5 U·mg-1）及中性蛋白酶（15 U·mg-1）（上海賀寶化工有限公司）；95%食用酒精（哈爾濱市釀酒廠）；其他試劑均為分析純試劑。

1.3 酶-超聲波輔助提取工藝參數(shù)單因素優(yōu)化試驗

精確稱取藍莓果渣5 g，加入水于勻漿機中勻漿2 min，將勻漿液轉(zhuǎn)移到具塞三角瓶中，以超聲波為動力，分別考察加入酶的不同類別（果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶及不同復(fù)合酶）、超聲波功率（50、100、150、200和250 W）、不同溫度條件（30、40、50和 60℃）、酶用量（2、5、8、10和15 mg·g-1）、培養(yǎng)提取時間（10、15、20、25、30和50 min）對果渣中花青素提取的影響，從而確定最優(yōu)的提取條件。然后，向體系中補充加入95%的食用酒精，進一步超聲波強化提取，提取液經(jīng)離心、過濾后定容，測定花青素含量。

1.4 酶-超聲波輔助提取工藝參數(shù)正交試驗優(yōu)化

上述單因素試驗結(jié)果表明，采用纖維素酶-超聲波輔助提取藍莓果渣最合適，超聲波最適功率為200 W，隨后補充加入乙醇至40%濃度強化提取10 min，在此條件下以酶輔助提取溫度（A）、酶用量（B）、料液比（C）和酶培養(yǎng)時間（D）為考察因素，對提取工藝采用L9（34）正交表進行正交試驗研究，從而確定最佳的提取條件。

1.5 藍莓果渣中花青素含量的測定[11]

取藍莓果渣花青素提取液1 mL，分別加入pH 1.0和pH 4.5緩沖體系，定容至10 mL，分別于530和700 nm測定吸光度，以吸光度表示花青素的提取量，用示差法按照下述公式計算：

1.6 數(shù)據(jù)分析

每個處理重復(fù)3次，取平均值，所得數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行分析，用不同字母表示顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇試驗

以水為溶劑、料液比 1：20（g：mL）、40 ℃條件下，按照15 mg·g-1用量加入不同的酶于150 W超聲波清洗器中培養(yǎng)提取30 min，考察酶種類對藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶和三種酶的任意復(fù)合酶對藍莓果渣中花青素提取的影響Fig.1 Effect of enzymatic types(cellulase,pactin,neutral protease and complex enzyme)on the extraction of anthocyanins

由圖1可知，加入酶后，藍莓果渣中花青素的提取增加。其中，纖維素酶使花青素的提取增加顯著，果膠酶和中性蛋白酶作用較弱，花青素提取提高不明顯，這與前人報道的酶法從藍莓果或者藍靛果果渣中提取花色苷所得結(jié)果相似。藍莓果渣中大部分是纖維素組成的果皮，纖維素酶的加入可以溫和地分解、破壞細胞壁，加速花青素的釋放。果渣中果膠和蛋白質(zhì)相對很少，使得果膠酶和中性蛋白酶的作用不明顯。同時，上述三種酶的任意復(fù)合酶對花青素提取的影響均低于相同用量的纖維素酶，其中，僅纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶與單一使用纖維素酶的差別較小，說明果膠酶和纖維素酶之間的協(xié)同作用不明顯，而蛋白酶與纖維素酶之間呈負協(xié)同。因此，選擇單一的纖維素酶進行藍莓果渣中花青素的輔助提取試驗。

2.2 酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取功率對花青素提取量的影響

以水為溶劑、料液比 1： 20（g： mL）、40 ℃條件下，按照15 mg·g-1用量加入纖維素酶，在不同的超聲波功率條件下（50、100、150、200和250 W）培養(yǎng)提取30 min，酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取功率對花青素提取量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取功率對花青素提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic incubation power on the extraction of anthocyanins

由圖2可知，花青素的提取量隨超聲波功率的增加而增加，當(dāng)超聲波功率為200 W時，藍莓果渣中的花青素提取量達到最大，繼續(xù)增加功率，花青素的提取量反而減小。因為適當(dāng)?shù)某暡üβ士梢源龠M酶與底物的結(jié)合，從而增加提取量，但是過高的超聲波功率可能對目標物質(zhì)、酶以及酶促反應(yīng)過程造成破壞，導(dǎo)致提取量降低。因此，在本試驗中選擇超聲波200 W功率用于果渣中花青素的纖維素酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取。

2.3 酶輔助提取溫度對花青素提取量的影響

在其他參數(shù)不變的條件下，考察溫度對纖維素酶輔助提取藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對花青素提取的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction of anthocyanins

由圖3可知，花青素的提取隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達到50℃時，藍莓果渣中的花青素提取量達到最大，當(dāng)溫度升高至60℃時，花青素的提取量繼而減小，試驗結(jié)果與報道的從藍莓果中提取花色苷所用溫度一致[16-18]。因為酶促反應(yīng)在最適合的溫度條件下速度最快，在較低溫度下，底物的分子熱能較低，酶促反應(yīng)速度慢，當(dāng)溫度過高時，酶易變性失活。因此，在本試驗中選擇50℃用于果渣中花青素的纖維素酶輔助提取。

2.4 酶用量對花青素提取量的影響

在以水為溶劑、料液比 1： 20（g： mL）、50 ℃、加入纖維素酶，超聲功率200 W，培養(yǎng)提取30 min的條件下，考察纖維素酶用量對藍莓果渣中花青素提取量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶用量對花青素提取的影響Fig.4 Effect of enzyme addition on the extraction of anthocyanins

由圖4可知，當(dāng)纖維素酶用量達到5 mg·g-1后，繼續(xù)增加酶用量，花青素的提取量不再增加，因為酶作用的底物量是一定的，當(dāng)?shù)孜锉幻赋浞肿饔煤螅^續(xù)增加酶的用量不會導(dǎo)致花青素釋放量的增加。因此，纖維素酶的加入量確定為5 mg·g-1，該用量與李穎暢等[17]提取藍莓果中花色苷的酶用量一致，其原因是纖維素酶主要作用于果皮和果籽。

2.5 料液比對花青素提取量的影響

以水為溶劑、50℃條件下，加入5 mg·g-1纖維素酶，超聲功率200 W，以不同的料液比培養(yǎng)提取30 min，考察料液比對藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對花青素提取的影響Fig.5 Effect of solid to liqiud ratio on the extraction of anthocyanins

由圖5可知，花青素的提取量隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比為1：10時即達到了最大值，繼續(xù)增加至1：20，花青素提取量基本不變，但是當(dāng)料液比達到1：25時，花青素的提取量開始減少。因為過量溶劑的使用一方面降低了酶的濃度，從而降低了酶與底物的接觸；另一方面導(dǎo)致其他雜質(zhì)的大量提取，從而降低了花青素的提取量。為了操作方便，選擇料液比1：10。

2.6 纖維素酶培養(yǎng)提取時間的確定

以水為溶劑、料液比 1： 10（g：mL）、50 ℃條件下，按照5 mg·g-1用量加入纖維素酶，超聲功率200 W培養(yǎng)提取不同時間，考察培養(yǎng)提取時間對藍莓果渣中花青素提取的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，花青素的提取隨著培養(yǎng)提取時間的增加而增加，并在20 min時即達到最大，之后基本保持不變。因為纖維素酶與底物的作用需要一定的時間，當(dāng)酶促反應(yīng)充分發(fā)生后，酶的效率得到充分利用，繼續(xù)增加時間，花青素的提取不再增加。因此，選擇20 min用于酶培養(yǎng)提取試驗。這一結(jié)果遠遠優(yōu)于相關(guān)報道的2～3 h[16-18]，因為超聲波的作用能夠大大促進酶與底物的接觸，從而實現(xiàn)高效提取。

圖6 培養(yǎng)提取時間對花青素提取的影響Fig.6 Effect of extraction time on the extraction of anthocyanins

2.7 超聲波-乙醇強化提取過程中乙醇濃度和時間的影響

為了最大量地提取藍莓果渣中的花青素，對酶培養(yǎng)提取的藍莓果渣進行進一步超聲波-乙醇強化提取。在上述優(yōu)化的酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取的條件下，對乙醇的加入方式、加入量和強化提取時間進行了優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。由表1可知，在強化提取過程中，兩種乙醇的加入方式對花青素的提取沒有明顯影響，當(dāng)體系中乙醇濃度為40%時，強化提取10 min后即可獲得較大的花青素吸光值，繼續(xù)增加體系中乙醇含量或者延長時間對花青素提取沒有明顯的影響。與已有的報道用50%乙醇[19]或80%甲醇[20]提取花青素相比，本試驗采用40%乙醇所得效果更好，并且更安全。因此，為了簡化操作程序，選擇在酶培養(yǎng)提取的體系中直接補充加入乙醇，使得體系中乙醇的最終濃度為40%，在此條件下，強化提取10 min，此時，通過計算可知花青素提取物的得率為4.12%。

2.8 正交試驗分析

正交試驗因素水平與結(jié)果如表2所示。由正交試驗結(jié)果可以看出，影響提取效果的因素排序為A＞D＞C＞B，酶用量對花青素提取量影響最小，方差分析結(jié)果表明，5與8 mg·g-1的酶用量對花青素提取沒有顯著影響，溫度、提取時間和料液比對花青素提取影響較大，因此，取酶用量8 mg·g-1，溫度50℃，料液比1：10，提取時間20 min。

表1 乙醇的加入方式、加入量和強化提取時間對花青素提取的影響Table1 Effect of ethanol addition methods,amounts and extraction time on the extraction of anthocyanins

表2 正交試驗因素水平Table2 Factors and levels of orthogonal test

3 結(jié)論

花青素又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物[13]，花青素作為一種天然食用色素，具有安全、無毒、資源豐富、藥理作用顯著的特點，在食品、化妝、醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛力[14]。

試驗結(jié)果表明，纖維素酶輔助提取花青素的效果最好，其最佳工藝條件為：溫度50℃，酶用量5mg·g-1，以料液比1：10加入水培養(yǎng)提取20min，然后補充加入乙醇，使得體系中乙醇濃度為40%，強化提取10 min，所得藍莓果渣中花青素的提取率為4.12%。但在使用酶-超聲波輔助培養(yǎng)提取過程中，需要注意的是花青素的提取率并不是隨著超聲波功率的增加而提高。功率過高反而會造成提取率的下降。

酶-超聲波輔助提取藍莓果渣中花青素的方法是一個利用現(xiàn)代生物技術(shù)和物理技術(shù)進行試驗的方法，具有提取率高、工藝簡單、條件溫和等特點，其應(yīng)用前景廣闊。

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