小鼠腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞微核率的最佳時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)分析

常 征

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)院,云南昆明 650092;2.文山學(xué)院生化系,云南文山 663000)

小鼠腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞微核率的最佳時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)分析

常 征1,2

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)院,云南昆明 650092;2.文山學(xué)院生化系,云南文山 663000)

目的:尋找一次染毒條件下,腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞微核率出現(xiàn)峰值的時(shí)間 -劑量條件。方法:將 150只小鼠隨機(jī)分為 5組,每組 30只,雌雄各半。腹腔注射,1次給藥,對(duì)照組給生理鹽水,處理組的阿霉素劑量分別是 2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg和 20 mg/kg。染毒 18 h、24 h、30 h、48 h和72 h后取小鼠骨髓進(jìn)行微核分析,評(píng)價(jià)阿霉素對(duì)小鼠的遺傳毒性作用。結(jié)果:理想的腹腔注射誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞微核率峰值的條件就是:一次染毒,阿霉素劑量在 10%LD50即 2.5 mg/kg至 80%LD50即 20 mg/kg的范圍內(nèi)劑量越大微核率越高,取樣時(shí)間在 30～48 h間微核率最高。

阿霉素;小白鼠;腹腔注射;微核率;時(shí)間 -劑量效應(yīng)

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種健康小白鼠,150只,體重 18～22 g,雌雄各半,[云南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證:SCXK(滇 2005 -0008)]。購(gòu)于昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品

注射用鹽酸多柔比星 (阿霉素),10 mg裝,深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號(hào):0808E1,生產(chǎn)日期:20080823。

氯化鈉注射液,250 mL裝,昆明南疆制藥有限公司 生 產(chǎn),產(chǎn) 品 批 號(hào):B081111h1,生 產(chǎn) 日期:20081111。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥品的配制

用 1 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL的注射器取生理鹽水注射到 10 mg裝阿霉素中配制成不同濃度,混勻后,用 1 mL的注射器吸取并腹腔注射小鼠。

1.1.4儀器設(shè)備

日本奧林巴斯BX51系統(tǒng)熒光顯微鏡;800型離心機(jī) (金壇市大地自動(dòng)化儀器廠)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)方法

將 150只小鼠隨機(jī)分成 5個(gè)組,每組 30只,雌雄各半。對(duì)照組 (CK)腹腔注射生理鹽水一次,其余四組分別以 10%LD50、20%LD50、40%LD50和80%LD50的阿霉素劑量腹腔注射一次,注射量為0.1～0.2 mL/10 g體重[16]。隨后再將每組小鼠隨機(jī)分為 5個(gè)小組,每小組 6只,雌雄各 3只,分別于給藥結(jié)束后的 18 h、24 h、30 h、48 h和 72 h用頸椎脫臼法處死、取樣。

小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)方法參照了肖福英[1]、Makoto Hayashi[6]和汪旭[5,17,18]等的方法,稍加改動(dòng)。取小鼠股骨,剪去股骨的兩端,每條股骨用 1 mL生理鹽水沖洗骨髓腔,每只小鼠用一個(gè)離心管。將骨髓沖洗液 1 000 r/min離心 5 min,棄大部分上清液,留少許液體 (約 0.2 mL),輕輕震蕩使細(xì)胞均勻分散開來。用毛細(xì)吸管在每個(gè)載玻片上滴兩滴,用血常規(guī)涂片法涂片,自然干燥,甲醇固定 10 min,晾干,Giemsa原液用磷酸緩沖液 (PH6.8)按 1∶20的比例稀釋,染色 20 min。自來水輕輕沖去多余染液,充分晾干,中性樹膠封片,在油鏡下對(duì)每只小鼠骨髓細(xì)胞分別計(jì)數(shù) 1 000個(gè),再分別統(tǒng)計(jì)其微核發(fā)生率。計(jì)數(shù)細(xì)胞要符合以下條件:①細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,即必須有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,且細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核對(duì)比明顯;②細(xì)胞核著色鮮明、均勻且邊緣相對(duì)光滑;③部分被污物或其它細(xì)胞組織遮蓋的細(xì)胞不計(jì)數(shù),但是如果已經(jīng)確認(rèn)是微核細(xì)胞則計(jì)數(shù)。

1.2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示,所有數(shù)據(jù)用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,劑量 -反應(yīng)關(guān)系進(jìn)行直線相關(guān)分析,計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1不同劑量阿霉素注射后對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

不同劑量阿霉素注射后小鼠骨髓細(xì)胞微核統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。表1中通過對(duì)劑量與微核發(fā)生率的相關(guān)性分析 (見圖1),可以看出:阿霉素的腹腔給藥劑量與小鼠骨髓細(xì)胞的微核發(fā)生率有極顯著的正相關(guān)性 (p<0.01),即小鼠骨髓細(xì)胞的微核發(fā)生率隨阿霉素的腹腔給藥劑量的增大而極顯著地增大,它們表現(xiàn)出了極顯著的劑量 -反應(yīng)關(guān)系。而通過對(duì)各給藥劑量間微核發(fā)生率 (‰)均數(shù)的兩兩比較 (S -N-K法)可以看出:所有給藥組的微核率都極顯著地高于陰性對(duì)照組 (p<0.01),這說明一次染毒就可造成微核率的顯著上升。同時(shí)還可以看出20%LD50組的微核率極顯著地高于 10%LD50組 (p <0.01),40%LD50組的微核率極顯著地高于 20% LD50組 (p<0.01),只有 80%LD50組與 40%LD50組的微核率相比較差異不顯著 (p>0.05)。

2.2不同取樣時(shí)間對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

表1中通過對(duì)各取樣時(shí)間間微核發(fā)生率 (‰)均數(shù)的兩兩比較 (S-N-K法)看出:30 h和 48 h時(shí)取樣的微核率顯著 (p<0.05)甚至是極顯著 (p <0.01) (用 p=0.01進(jìn)行檢驗(yàn)結(jié)果同樣成立)高于 18 h、24 h和 72 h時(shí)取樣的微核率;而 18 h、24 h和 72 h取樣時(shí),微核率差異不顯著 (p>0.05), 30 h與 48 h取樣時(shí),微核率差異也不顯著 (p> 0.05)。但通過圖2可以看出:在所有的取樣時(shí)間里,48h取樣時(shí)微核率是最高的,48 h后微核率逐漸下降。阿霉素腹腔注射后隨取樣時(shí)間不同,小鼠骨髓細(xì)胞微核率統(tǒng)計(jì)結(jié)果變化見表1。各組小鼠骨髓細(xì)胞微核見圖3。圖中箭頭所示為小鼠骨髓細(xì)胞微核。

表1 不同劑量、不同取樣時(shí)間阿霉素對(duì)骨髓微核率的影響 (‰)

圖3 阿霉素誘發(fā)小鼠骨髓細(xì)胞形成的微核

3 討 論

微核作為檢測(cè)染色體損傷的重要指標(biāo)之一,其出現(xiàn)峰值的時(shí)間因不同化合物而異,波動(dòng)范圍可能在 18～72 h內(nèi),大多數(shù)化合物誘發(fā)形成的微核,其檢出峰值在給藥后的 24～30 h間,72 h后出現(xiàn)峰值的情況很少見[6]。而且同一化合物,如果給藥的劑量與途徑不同,動(dòng)物種屬不同,微核率峰值出現(xiàn)的時(shí)間也不同[19-21]。因此,合理的選擇取樣時(shí)間和給藥劑量對(duì)獲得較高的微核率顯得尤為重要。在本實(shí)驗(yàn)中,小鼠一次染毒 18 h后,骨髓細(xì)胞微核率就明顯升高,直到48 h時(shí)出現(xiàn)峰值 (當(dāng)然,30 h與 48 h時(shí)的微核率差異不顯著 (p>0.05),或稱沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),這與付小鎖[22],許重潔[23-24]的阿霉素兩次染毒得到的小鼠骨髓細(xì)胞微核率出現(xiàn)峰值的時(shí)間是一致的。這表明,要獲得理想的腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞微核率峰值,無須進(jìn)行二次染毒,一次染毒即可得到。這不僅可以節(jié)約一定的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi),同時(shí)也可以節(jié)約一定的時(shí)間和精力。另外,本實(shí)驗(yàn)同樣也得出了與付小鎖[22],許重潔[23-24]相同的劑量 -反應(yīng)關(guān)系結(jié)果,即小鼠骨髓細(xì)胞的微核發(fā)生率隨阿霉素的腹腔給藥劑量的增大而極顯著地增大,并對(duì)它進(jìn)行了線性相關(guān)分析,得到了相關(guān)性極顯著 (p<0.01)的結(jié)果。最后,本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果就是:理想的腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)的小鼠骨髓細(xì)胞微核率峰值的條件為:一次染毒,劑量在 10% LD50即 2.5 mg/kg至 80%LD50即 20 mg/kg的范圍內(nèi)越大微核率越高,取樣時(shí)間在 30～48 h間微核率最高。

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(責(zé)任編輯 劉常福)

AStudy of the Optimal Time-Dose Effect of Doxorubici n on I nducing the Micronucleus Frequency in Mouse Bone Marrow by I ntraperitoneal I njection(i.p.)

CHANG Zheng1,2
(1.School ofLife Science,Yunnan Nor malUniversity,Kunming Yunnan 650092,China; 2.Department ofBiology and Chemistry,Wenshan University,Wenshan Yunnan 663000,China)

Objective to study ti me-dose effect of doxorubicin on inducing the micronucleus frequency in mouse bone marrow by intraperitoneal injection once.Methods 150 mice are divided into 5 groups randomly,30 mice one group,half male and half female.Each mouse is injected once by intraperitoneal injection.The dose is:control group is injected pHysiological saline;the dose of the remaining four groups is 2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg respectively.Micronucleus test were performed in mice after 18 h,24 h,30 h,48 h or 72 h,and the micronucleus frequency in mouse bone marrow and estimating doxorubicin genotoxicity in mice were counted.Results In the range of 2.5～20 mg/kg,with the increasing of dose,the percentage ofmicronucleus is higher,and the optimal sampling time is 48h after treatment.

Doxorubicin;Mice;Intraperitoneal injection;Micronucleus Frequency;Time-Dose Effect

R979.1

A

1674-9200(2010)02-0108-05

微核 (micronucleus,簡(jiǎn)稱 MN),也叫衛(wèi)星核,是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu),是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。微核往往是各種理化因子,如輻射、化學(xué)藥劑對(duì)分裂細(xì)胞作用而產(chǎn)生的。在細(xì)胞有絲分裂間期,微核呈圓形或橢圓形,游離于主核之外,大小應(yīng)在主核 1/3以下。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞通過兩種機(jī)制產(chǎn)生微核:一是染色體斷裂劑導(dǎo)致染色體斷裂,產(chǎn)生無著絲粒斷片或環(huán),不能進(jìn)入子細(xì)胞核,被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的微核;二是紡錘絲毒性藥物能抑制紡錘絲的形成,破壞染色體和紡錘體的連接,阻止細(xì)胞分裂中期紡錘絲將染色體拉至細(xì)胞的兩端,染色單體行動(dòng)滯后,不能進(jìn)入子細(xì)胞的主核,而形成了一組微核,這樣形成的微核體積往往略大于一般典型的微核。由于微核的產(chǎn)生與染色體和DNA損傷有較大關(guān)系,故常將微核的檢出率作為DNA損傷的一種指標(biāo)[1]。微核實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建于 20世紀(jì) 70年代中期[2-3],而小鼠微核試驗(yàn)是目前檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致染色體損傷方便、快速的方法,是遺傳毒理實(shí)驗(yàn)常用的細(xì)胞遺傳學(xué)方法之一[4-5]。所以目前許多國(guó)家(地區(qū))和國(guó)際組織都將其視為評(píng)價(jià)新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等化合物毒理安全性的必做試驗(yàn)之一[6-7]。

阿霉素——也叫亞德里亞霉素,屬蒽環(huán)類藥物,它被用作一種高效、廣譜的抗腫瘤藥物已有近 40年的歷史,對(duì)乳腺癌、食道癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、Kaposi肉瘤和軟組織肉瘤均有較好的療效[8]。阿霉素具有抑制 DNA合成的能力[9],還具有引起 DNA鏈斷裂的潛能[10-11];阿霉素的細(xì)胞毒性作用可能通過各種各樣的機(jī)制發(fā)生,如DNA的綁定、自由基的形成、膜成分的改變和功能喪失等等。先前的研究顯示,阿霉素能誘導(dǎo)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞發(fā)生突變和染色體畸變[9,12,13],但在阿霉素的小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)中,微核檢出率受到諸多因素影響,如小鼠品系、性別、給藥途徑、給藥次數(shù)、劑量以及制片、染色、檢測(cè)方法等,其中最重要的因素是用藥劑量和采樣觀察時(shí)間等[14],因此,筆者設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)來檢測(cè)阿霉素誘發(fā)產(chǎn)生微核的最佳時(shí)間和劑量。在筆者[15]前面的實(shí)驗(yàn)中,得到了阿霉素腹腔注射昆明種小白鼠的半致死劑量LD50值為 24.941 mg/kg,95%的可信限為 21.241～29.271 mg/kg。而在本實(shí)驗(yàn)中,筆者用 10%LD50、20%LD50、40%LD50和 80%LD50等四個(gè)劑量和 18 h、24 h、30 h、48 h、72 h等五個(gè)取樣時(shí)間[6]進(jìn)行交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)討論了小鼠腹腔注射阿霉素誘發(fā)產(chǎn)生微核的最佳時(shí)間和劑量的問題,這將對(duì)阿霉素的臨床應(yīng)用提供一定的參考依據(jù),同時(shí)本試驗(yàn)的方法和結(jié)果又對(duì)相關(guān)人員具有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。

2009-09-25

常 征 (1975-),男,云南馬關(guān)人,副教授,主要從事生物化學(xué)和遺傳學(xué)方面的教學(xué)和研究。