3種杏香兔耳風提取物抑菌活性的研究

李桂蘭 芮 成

江西省醫(yī)藥學校（330200）

杏香兔耳風Ainsliaea fragrans Champ.為我國傳統(tǒng)中藥，民間以全草入藥，具有清熱補虛、涼血止血、利濕解毒、發(fā)表祛風等作用。已有研究發(fā)現，杏香兔耳風中具有良好的抗炎效果，本實驗測定了3種杏香兔耳風提取物對常見菌的抑制作用，闡明了其抑菌活性，旨在能開發(fā)出一種天然的抑菌藥，為杏香兔耳風臨床開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

杏香兔耳風提取物A、杏香兔耳風提取物B和杏香兔耳風提取物C，由本院制劑室提供，置于冰箱中冷藏備用。

1.2 供試菌種

細菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、沙門菌（Salmonella sp.）；霉菌：黑曲霉（Aspergillus niger）、桔青霉（Penicillium citrinum）；酵母菌：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由南京師范大學生科院和南京中醫(yī)藥大學微生物實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基[1]

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于細菌的培養(yǎng)），具體組成為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂15～20g、水1000mL、pH 7.2～7.4；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（用于霉菌和酵母菌的培養(yǎng)），具體組成為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、水1000mL、pH自然（將馬鈴薯去皮，切成小塊，置于鍋中并加水1000mL，煮沸半個小時，用雙層紗布過濾，取其濾液加葡萄糖20g，加瓊脂15～20g，并加水補足1000mL，調pH成自然）。

1.4 試劑

乙醇、氫氧化鈉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀所用試劑均為分析純，市售的豬肉、茄子、豆腐。

1.5 儀器與設備

HH-2型恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司），KS-120D超聲波清洗器（寧波海曙科聲超聲設備有限公司），D-1型自動蒸氣滅菌鍋（北京發(fā)恩科貿有限公司），DGF30/7-IADC型電熱鼓風干燥箱（南京實驗儀器廠），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），手動（可調試）移液槍（上海大龍醫(yī)療設備有限公司）

2 實驗方法

2.1 菌懸液的制備

取試管若干，裝入融化的培養(yǎng)基滅菌后擺成斜面。在無菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應的斜面培養(yǎng)基上，每個菌種活化多支，放入培養(yǎng)箱中，細菌37℃下培養(yǎng)18～24h，酵母菌和霉菌于28℃下培養(yǎng)48h。然后取出置于4℃冰箱中冷藏。取出活化好的菌種，無菌操作，用適量的滅過菌的生理鹽水洗入已滅菌的干凈試管中，然后根據實驗的需要采用比濁法[2]配置成含菌數為106～107CFU/mL的菌懸液，備用。

2.2 濾紙片擴散法測定杏香兔耳風提取物的抑菌能力

參考姚淑敏[3]的方法并略有改進，將配制好滅過菌的固體培養(yǎng)基溶化后倒入培養(yǎng)皿中，每皿20mL，待冷卻、凝固后，用無菌吸管分別加入0.1mL相應的待試菌懸液，用無菌涂布器將菌液涂布均勻，制成含菌平板，置37℃恒溫箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，待用。選擇吸水性強的新華一號定性濾紙，用打孔器打成若干直徑為6mm的圓形濾紙片，分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿內，50張/皿，干熱滅菌后，浸在提取液中，備用。在超凈臺里將平板平均分為6個區(qū)，對角設置對照組，用無菌鑷子鑷取浸有提取液的濾紙片貼在含菌平板上，用浸有無菌水的濾紙片作對照。每菌做3次重復，取其平均值。放入培養(yǎng)箱恒溫倒置培養(yǎng)，細菌置37℃培養(yǎng)24h，霉菌和酵母菌置28℃下培養(yǎng)48h，取出后測出濾紙片抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定

參照謝主蘭[4]的方法略有改動，將配置的固體培養(yǎng)基在121℃、0.1 MPa條件下滅菌30min，當滅菌培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在無菌條件下準確量取不同體積的提取液加入固體培養(yǎng)基中，配制成濃度5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%的杏香兔耳風提取物系列培養(yǎng)基，每個濃度做3個重復。以不加提取物溶液的培養(yǎng)基為陰性對照。冷卻凝固后，每平皿加入0.1mL的菌懸液，涂勻，將細菌置于37℃下培養(yǎng)24h，霉菌和酵母菌置于28℃下培養(yǎng)48h，觀察生長情況以不長菌的最低提取物溶液濃度為該提取物的最低抑菌濃度。

2.4 抑菌或殺菌活性的初步探討[5]

用濾紙片法測定杏香兔耳風提取物對四種細菌的抑菌或殺菌效果，37℃下恒溫培養(yǎng)24h后，再分別從平板透明抑菌圈中挑取一小塊瓊脂進行液體培養(yǎng)18h后，再涂平板，于37℃下恒溫培養(yǎng)24h后，觀察各平板上菌落的生長情況，有菌落生長即表示提取液對細菌具有抑菌作用，無菌落生長即表示提取液對細菌具有殺菌作用。

3 結 果

3.1 濾紙片擴散法測定杏香兔耳風提取物的抑菌能力

3種杏香兔耳風片提取物的抑菌作用結果見表1。由表1可知3種杏香兔耳風提取物對供試細菌都有一定的抑制作用，其中杏香兔耳風提取物A對大腸桿菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到（12.2±0.27）mm，其次為金黃色葡萄球菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌。杏香兔耳風提取物B對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，抑菌圈直徑達到（15.8±0.16）mm，其次為沙門菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。闊瓣含笑對大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到（19.0±0.36）mm，其次為沙門菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。杏香兔耳風提取物C對啤酒酵母有微弱的抑菌效果，抑菌圈直徑為（7.2±0.15）mm。杏香兔耳風提取物A和杏香兔耳風提取物B對霉菌和酵母菌以及杏香兔耳風提取物C對霉菌都無明顯的抑菌作用。

表1 3種杏香兔耳風提取物的抑菌效果

3.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

杏香兔耳風提取物A、杏香兔耳風提取物B和杏香兔耳風提取物C對供試菌的最低抑菌濃度實驗結果見表2～4。表2～4中的數據進一步表明，3種提取物對細菌的抑菌能力明顯大于酵母菌和霉菌。從表2可以看出，隨著提取物溶液濃度的增加，3種杏香兔耳風提取物抑菌作用相應增強，杏香兔耳風提取物A對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.313%，對枯草芽孢桿菌為0.625%；杏香兔耳風提取物A濃度較高時對酵母菌也有一定的抑菌作用，其MIC為10%。從表3可知，杏香兔耳風提取物B對金黃色葡萄球菌的MIC為0.156%，對沙門菌的MIC為0.625%，對大腸桿菌和枯草桿菌的MIC為1.25%。由表4可以看出，杏香兔耳風提取物C對大腸桿菌的MIC為0.156%，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門菌的MIC分別為1.25%、0.625%和0.313%；對酵母菌的MIC為2.5%?？梢?種提取物在較低濃度下對細菌都有較明顯的抑制作用，在較高濃度時對酵母菌有一定的抑制作用，對霉菌基本無抑制。

3.3 抑菌或殺菌活性的初步探討

由表5可知，杏香兔耳風提取物A和杏香兔耳風提取物B對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有殺菌作用，而對大腸桿菌和沙門菌可能是抑菌作用；杏香兔耳風提取物C對四種細菌可能都是抑菌作用。

4 討 論

對一種未知抑菌物質中有效成分抗菌效力的測定，通常是借鑒抗生素微生物檢定法，即利用物質抑制或殺死細菌或真菌的程度作為客觀指標來衡量物質中有效成分效力的一種方法。根據實驗設計原理的不同，檢定法一般分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴散法。稀釋法包括液體稀釋法和固體稀釋法，現在已不用來測定抗菌物質的效價，而以之測定抗菌物質的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。該方法程序繁瑣，實驗結果亦受多種因素影響，即使控制實驗條件一致，也會因逐級稀釋造成的誤差、物質分散的不均勻，導致所得的MIC值可能會有偏差。瓊脂平板擴散法是利用抗菌物質在瓊脂中擴散使其周圍的細菌生長受到抑制而形成抑菌圈，根據抑菌圈大小來判斷細菌和真菌對抑菌物質的敏感程度，得出抗菌物質的抑菌作用大小和抗菌譜的一種方法。此法簡便、易操作，但因抑菌圈大小受多種因素影響，如培養(yǎng)基成分、pH值、瓊脂來源和濃度、培養(yǎng)溫度和時間、藥效、藥液濃度等，即使控制條件一致，也會因不同菌種生長到肉眼可見所需時間不同、不同物質擴散系數不同，因而精確度不夠高，一般只能用于定性或初步判斷其作用強弱。因此本實驗采用稀釋法和擴散法共同對杏香兔耳風提取物的抑菌效果進行檢測，以求達到一個更加準確的結果。

表2 杏香兔耳風提取物A對供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

表3 杏香兔耳風提取物B對供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

表4 杏香兔耳風提取物C對供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

表5 3種杏香兔耳風提取物的抑菌或殺菌的初步探討

由表1～5可知，3種杏香兔耳風提取物對所選的細菌都有較強的抑菌作用，其中杏香兔耳風提取物A對大腸桿菌抑菌效果最好，杏香兔耳風提取物B對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，杏香兔耳風提取物C對大腸桿菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直徑分別為（12.2±0.27）、（15.8±0.16）、（19.0±0.36）mm，最低抑菌濃度分別為 0.313%、0.156%、0.156%。但是3種杏香兔耳風提取物對酵母菌的抑制作用不強，對霉菌基本無抑制作用。杏香兔耳風提取物A和杏香兔耳風提取物B對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌殺菌作用，而對大腸桿菌和沙門菌可能是抑菌作用；杏香兔耳風提取物C對4種細菌可能都是抑菌作用。因此，3種杏香兔耳風提取物具有良好的臨床開發(fā)應用價值。

[1] 沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M] .北京：高等教育出版社,1999.

[2] 范秀容,李廣武.微生物學實驗[M] .2版.北京：高等教育出版社,1989.

[3] 姚淑敏.蘆薈提取物抑菌作用的研究[J] .食品科學,2002,23(4)：137-139.

[4] 謝主蘭,吳文龍.榕樹葉抑菌作用的試驗研究[J] .食品研究與開發(fā),2004,23(2)：7-9.

[5] 胡靜麗.楊梅葉提取物抑菌作用的研究[D] .杭州：浙江大學,2002.