小鼠超高硫角蛋白基因啟動子的克隆及其表達(dá)活性分析

李昊，王春生，寧方勇，2，梁洋，樸善花，安鐵洙

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，哈爾濱 150030)

小鼠超高硫角蛋白基因啟動子的克隆及其表達(dá)活性分析

李昊1，王春生1，寧方勇1，2，梁洋1，樸善花1，安鐵洙1

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，哈爾濱 150030)

目的 篩選在小鼠毛囊中具有高表達(dá)活性的內(nèi)源啟動子，為建立小鼠被毛特異表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因技術(shù)奠定基礎(chǔ)。方法 以小鼠基因組為模板，克隆得到超高硫角蛋白基因啟動子超高硫角蛋白(UHS)，將其分別與pβgal-Basic和pAcGFP1-N1載體連接，構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體。采用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染胎鼠組織塊，分析其表達(dá)活性。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后48 h，在藍(lán)光激發(fā)條件下可以檢測到綠色熒光蛋白(GFP)在小鼠毛囊區(qū)高表達(dá)，轉(zhuǎn)染96 h后，表達(dá)減弱;此外，轉(zhuǎn)染后48 h，βgal染色結(jié)果顯示在皮膚塊的毛囊區(qū)存在藍(lán)色點狀區(qū)域。結(jié)論 UHS啟動子在小鼠毛囊中具有表達(dá)特異性。

超高硫角蛋白;啟動子;分子克隆;活性分析

隨著哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，利用皮膚特異性啟動子的改變動物被毛性狀的轉(zhuǎn)基因技術(shù)備受關(guān)注。Dunn等［1］(1998)利用角蛋白啟動子帶動生長激素在轉(zhuǎn)基因小鼠的毛囊特異表達(dá)。表明在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)過程中，正確選擇啟動子是外源基因在特異組織表達(dá)的前提。為了克隆在皮膚中特異且高表達(dá)的超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin，UHS)啟動子，本研究利用小鼠肌肉組織，克隆并分析UHS啟動子的表達(dá)活性，為建立在小鼠皮膚中特異表達(dá)外源基因新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、載體及菌株

rTaq、KpnI、BamHI、SmaI、T4 連接酶;AseI、PstI和AlwNI(NEB);Trizol(Invitrogen);質(zhì)粒小提小量試劑盒和膠回收試劑盒(Tiangen);pMD18 simple載體、TransDH5α 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 (TRANSGEN)。pAcGFP1-N1(Clontech)，pβgal-basic; β-gal染色試劑盒(Genmed)。

1.2 小鼠基因組提取

取ICR系小鼠(SCXK:J2007-0003)肌肉組織，常規(guī)方法提取小鼠基因組。

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中小鼠UHS啟動子序列(M27685)，利用 primer 5.0設(shè)計兩對特異性引物U1/U2和 U3/U4，其擴增后的片段長度均為686 bp。在U1/U2引物5’端分別引入 KpnⅠ和 BglⅡ酶切位點用于連接到pAcGFP1-N1載體，在U3/U4引物5’端分別引入 Nde I和 Kpn I用于連接到pβgal-basic載體。引物由大連寶生物公司合成。U1:5’-GGTACCTTGG AACATCCTGCCTAAG;U2:5’-AGATCTATGTGGAGGGAGGAGTTGT;U3:5’-CATATGTTGGAACATCCTGCCTAAG; U4: 5’-GGTACCATGTGGAGGGAGG AGTTGT。

1.4 啟動子片段的擴增

PCR 反應(yīng)體系 25 μL，其中基因組 2 μL(100 ng)，dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL，rTaq buffer(10 × )2.5 μL，上下游引物各 1 μL，rTaq 酶 0.3 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，循環(huán)數(shù)為30，條件設(shè)置為 94℃變性 30 s，54℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，結(jié)束循環(huán)后72℃再延伸7 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收后，分別于pMD18 simple載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α型感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選。挑取白色克隆于含有 Amp的LB培養(yǎng)液中搖菌，小提小量試劑盒提取質(zhì)粒。

重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定后送Invitrogen公司測序。若測序鑒定正確，則重組質(zhì)粒分別命名為U12-pMD18和 U34-pMD18。

1.5 含啟動子片段的真核表達(dá)載體的構(gòu)建

pAcGFP1-N1質(zhì)粒經(jīng)AseⅠ和 KpnⅠ雙酶切后，回收約4 kb的載體部分，并與U34-pMD18經(jīng)NdeⅠ和 KpnⅠ酶切獲得的約700 bp的啟動子部分連接，轉(zhuǎn)化，PCR鑒定和酶切鑒定后獲得重組質(zhì)粒 UGFP;pβgal-Basic質(zhì)粒經(jīng) KpnⅠ和 BglⅡ雙酶切后，回收約 7.5 kb的載體部分，并與 U12-pMD18經(jīng)KpnⅠ和BglⅡ酶切獲得的約700 bp的啟動子部分連接，轉(zhuǎn)化，PCR鑒定和酶切鑒定后獲得重組質(zhì)粒U-β-gal。

1.6 啟動子表達(dá)活性檢測

頸椎脫臼法處死懷孕18 d母鼠，75%酒精的脫脂棉對其進(jìn)行處理，解剖取出子宮。在培養(yǎng)皿中取出子宮內(nèi)的胎兒，分離胎鼠皮膚組織，用眼科鑷子仔細(xì)的去除附著在皮膚上的脂肪和結(jié)締組織基膜層，露出真皮層。

將上述分離得到的胎鼠皮膚組織置于mPBS的表面皿中清洗3～4次。漂洗后用剪刀將皮膚組織樣品剪成小塊(1 mm×1 mm ～2 mm×2 mm)。皮膚組織塊放在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔中放入6個左右的皮膚組織小塊，每孔加入500 μL含有10%血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基，加蓋并置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃，飽和濕度)進(jìn)行培養(yǎng)。采用陽離子脂質(zhì)體法分別將U-GFP和-β-gal轉(zhuǎn)染組織塊。組織塊轉(zhuǎn)染24 h、48 h后取出組織塊，在帶有藍(lán)光激發(fā)裝置的倒置顯微鏡觀察報告基因(綠色熒光蛋白)的表達(dá)情況，或制作冰凍切片，試劑盒檢測β-半乳糖苷酶的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠UHS啟動子的克隆

經(jīng)條件摸索后，確定PCR擴增的最佳退火溫度及時間。以小鼠基因組為模板，引物擴的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見在約700 bp處的特異擴增帶(如圖1)。

經(jīng)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工測序。采用DNAMAN、DNASTAR和 primer 5.0軟件進(jìn)行序列的拼接和分析;并與已發(fā)表的參照序列進(jìn)行比較分析。測序結(jié)果:UHS啟動子序列大小為682 bp，與GenBank上M27685(小鼠 UHS的參照序列)有98.22%的同源性;在576 bp處有依賴 DNA的RNA聚合酶識別位點 CAAT box，在599 bp處有依賴DNA的RNA聚合酶結(jié)合位點TATA box。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

鑒定正確的 U34-pMD18 simple用 NdeⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收短片段，與雙酶切(AseⅠ和KpnⅠ酶)去除自身CMV病毒啟動子的pAcGFP1-N1載體長片段連接，構(gòu)成表達(dá)載體，命名為U-GFP。因為酶切位點已經(jīng)改變，所以只能進(jìn)行PCR鑒定，如圖2所示，在700 bp左右擴增出特異條帶。

注:1:DL2000;2:PCR產(chǎn)物圖1 UHS啟動子PCR擴增Note:1.DL2000;2.PCR productsFig.1 The UHS promoter was amplified by RT-PCR

注:1:DL2000;2:U-GFP重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物圖2 U-GFP的PCR鑒定Note:1.DL2000;2:PCR product of U-GFPFig.2 PCR identification of recombinant plasmid UGFP

注:1:PCR產(chǎn)物;2:MarkerⅢ圖3 U-β-gal的 PCR 鑒定Note:1.MarkerⅢ;2:PCR product of U-β-galFig.3 PCR identification of U-β-gal

注:1:Marker III;2:假陽性;3:酶切產(chǎn)物圖 4 U-β-gal的酶切鑒定Note:1.MarkerⅢ ;2:U-β-gal/BamHⅠ、NcoⅠFig.4 Identification of U-β-galby restriction endonuclease digestion

鑒定正確的 U12-pMD18 simple用 KpnⅠ和BglⅡ酶切，回收短片段，與用KpnⅠ和 BglⅡ雙酶切的pβgal-Basic長片段連接，構(gòu)成表達(dá)載體，命名為UHS-β-gal。PCR得到了700 bp左右的片段(如圖3)。KpnⅠ和BglⅡ雙酶切檢測，得到約700 bp和約3000 bp的條帶(如圖4)，其與理論數(shù)值相符。

2.3 小鼠UHS啟動子的活性檢測

鑒定正確的U-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胎鼠皮膚組織塊24 h后，可以觀察到毛囊中GFP的表達(dá)。參見用UHS-β-gal轉(zhuǎn)染胎鼠皮膚組織塊，24 h后用試劑盒進(jìn)行X-gal染色，并制作冰凍切片。對照組中未發(fā)現(xiàn)X-gal染色。轉(zhuǎn)染 U-β-gal重組質(zhì)粒的皮膚塊中存在藍(lán)色點狀區(qū)域，即箭頭指示部位。見圖5～8(彩插6)。

3 討論

已 有 研 究報 道，KAP6［2］、Hox 基 因 Prox1［3］、FGF-2［4］和 KAP7-1［5］等基因在絨山羊不同發(fā)育時期的皮膚毛囊呈現(xiàn)特異的表達(dá)模式。另據(jù)Palmiter等［6］(1982)通過小鼠肝臟組織特異性啟動子和大鼠生長激素基因構(gòu)建融合基因，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得“超級鼠”。已有大量的研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)過程中，正確選擇啟動子是外源基因在特異組織表達(dá)的前提。上述結(jié)果為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變動物被毛特性提供了依據(jù)。

Powell等［7］(1997)的研究表明，毛發(fā)角蛋白基因(K2.9、K2.11、K2.10和 K2.12)僅在毛囊中處于分化中的角質(zhì)化細(xì)胞中表達(dá)。K2.10角蛋白屬于低硫 II角蛋白，Bawden等［8］(1998)通過構(gòu)建指導(dǎo)高效表達(dá)K2.10角蛋白的載體，并采用顯微注射法獲得了羊毛光澤和脆性發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因綿羊。另據(jù)Damak等［9］報道，利用小鼠超硫角蛋白啟動子區(qū)序列為前導(dǎo)區(qū)，可指導(dǎo)IGF1在轉(zhuǎn)基因綿羊表達(dá)而能提高羊毛產(chǎn)量。此外，王春生等［10］(2009)為了在綿羊被毛中表達(dá)擬蜘蛛絲蛋白基因，建立了轉(zhuǎn)pK2.10-擬蜘蛛絲蛋白基因綿羊成纖維細(xì)胞株。上述結(jié)果表明，選擇皮膚組織特異性啟動子可激活外源基因在皮膚中特異表達(dá)。

超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin，UHS)是毛發(fā)特異的結(jié)構(gòu)蛋白，屬于毛發(fā)角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(keratin associated proteins，KAP) 家族［11］。與動物體的其他蛋白相比，該蛋白家族含有最高的半胱氨酸且富含甘氨酸。與羊毛中超高硫角蛋白只占毛角蛋白組成的小部分不同，在小鼠和人類角蛋白中為主要組分。

為了建立在動物被毛中特異表達(dá)外源基因的方法，本研究選擇并克隆能夠在小鼠被毛中特異表達(dá)的小鼠超高硫角蛋白(UHS)啟動子(參見圖1)，將其連接pAcGFP1-N1載體分別構(gòu)建了U-GFP(參見圖 2)和 U-β-gal表達(dá)載體(參見圖 3、4)，分別轉(zhuǎn)染胎鼠皮膚組織塊，檢測其表達(dá)活性。其結(jié)果，所構(gòu)建U-GFP載體采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞后，經(jīng)24～48 h，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞中綠色熒光(參見圖 5、6)，表明啟動子 UHS可啟動GFP基因在小鼠成纖維細(xì)胞中具有表達(dá)活性;此外，當(dāng)用 U-β-gal表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胎數(shù)皮膚組織塊24 h后，利用試劑盒染色后，在可觀察到藍(lán)色的點狀區(qū)域(參見圖8)，表明 UHS啟動子可驅(qū)動 β-gal在皮膚塊細(xì)胞中特異表達(dá)。

綜上所述，本研究所克隆到的小鼠被毛特異表達(dá)的UHS啟動子，具有在胎鼠皮膚組織中表達(dá)的活性，如果將其與目的基因連接就有可能啟動外源基因在皮膚毛囊中特異表達(dá)，對此有待于進(jìn)一步探討。

(本文圖5～8見彩插6。)

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Cloning and Activity of Mouse Ultra-High Sulfur Keratin Gene Promoter

LI Hao1，WANG Chun-sheng1，NING Fang-yong1，2，Liang Yang1，PIAO Shan-hua1，AN Tie-zhu1
(1.College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China;2.College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

ObjectiveKeratin is the main structure albumen of the mammal wool，which is the most important part of the skin，hair and nail，etc.The aim of this study was to screen ultra-high sulfur keratin promoter in the hair follicles of mouse skin，and provide a basis for establishment of a transgenic technique for hair-specific expression of exogeneous protein.MethodsRegarding the genomic DNA from the mouse as a template，the mouse ultra-high sulfur keratin promoter(UHS)was cloned using molecular biologic methods，identified after conjugation with pMD18 simple vector and then insert it into pAcGFP-N1 plasmid，which had been excised the CMV promoter.After identification by PCR，a recombinant eukaryotic expression vector was constructed.At the same time，the promoter was linked to pβgal-basic，and recombination plasmid U-GFP and U-β-gal were obtained，respectively.The mouse skin tissue pieces were transfected by cationic liposomes of this plasmids.ResultsGFP expression was detected at mouse hair follicle region under blue light ilumination at 48 h after transfection，and the expression was decreased at 96 h after transfection.Moreover，at 48 h after transfection，blue dots of βgal staining were seen at the mouse hair follicle region.ConclusionThe UHS promoter is a tissue-specific promoter in the mouse hair follicles.

Ultra-high sulfur keratin;Promoter;Molecular cloning;Activity analysis;Mouse

圖5 藍(lán)光下轉(zhuǎn)染U-GFP的皮膚組織塊Fig.5 Skin piece transfected with U-GFP under blue light

圖6 藍(lán)光下對照組Fig.6 Skin piece of the control group

圖7 對照組冷凍切片F(xiàn)ig.7 A frozen section of the control group

圖8 轉(zhuǎn)染U-β-gal重組質(zhì)粒的皮膚組織塊冷凍切片F(xiàn)ig.8 A frozen section of skin piece transfected with U-β-gal

R349.64

A

1005-4847(2010)06-0471-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.06.005

2010-06-22

國家自然科學(xué)基金資助(編號:30771538);東北林業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動基金資助。

李昊(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。0451-82191785。E-mail:jayhaoli01@126.com

安鐵洙，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:antiezhu@tom.com