動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定甘草酸二銨注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的含量

蘇惠虹,沈小卓,張小薇

（廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校廣東廣州 510430）

動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定甘草酸二銨注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的含量

蘇惠虹,沈小卓,張小薇

（廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校廣東廣州 510430）

目的建立甘草酸二銨注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查方法,控制藥品質(zhì)量。方法 采用動(dòng)態(tài)濁度法,對(duì)甘草酸二銨注射液進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)、干擾實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)。結(jié)果甘草酸二銨注射液在16倍稀釋時(shí)無(wú)干擾作用。結(jié)論用該法檢測(cè)甘草酸二銨注射液中的內(nèi)毒素含量,結(jié)果準(zhǔn)確,可替代家兔法。

動(dòng)態(tài)濁度法;細(xì)菌內(nèi)毒素;甘草酸二銨注射液

甘草酸二銨注射液為中藥注射劑,其活性成分為甘草中的甘草次酸左旋構(gòu)型,是甘草有效成分的第三代提取物,具有較強(qiáng)的抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞膜及改善肝功能的作用。在臨床上用于伴有谷丙氨基轉(zhuǎn)移酶升高的急、慢性病毒性肝炎的治療。該品種目前《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）（2005版）二部[1]并未收載其熱原檢查方法。國(guó)內(nèi)曾有學(xué)者試驗(yàn)用鱟試劑凝膠法檢測(cè)其細(xì)菌內(nèi)毒素[2-6],而采用動(dòng)態(tài)濁度法未見(jiàn)有報(bào)道。筆者參照2005年版《中國(guó)藥典》二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn),在原用凝膠法試驗(yàn)法的基礎(chǔ)上探討動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)甘草酸二銨注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性,以期建立定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

1.1.1 動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（TAL） 規(guī)格 1.2 mL/Amp,湛江安度斯生物有限公司,批號(hào)0610230,可測(cè)內(nèi)毒素范圍:10～0.03 EU/mL。

1.1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 規(guī)格150 EU/Amp,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)2007-1。

1.1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水） 規(guī)格25 mL/Amp,湛江安度斯生物有限公司,批號(hào)0701310。

1.1.4 甘草酸二銨注射液 規(guī)格10 mL/Amp,批號(hào)0704072、0704182、0903132,江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司。

1.1.5 ATi/LKL 動(dòng)態(tài)試管分析儀,由 lab Kinetics Ltd（英國(guó)）生產(chǎn),湛江安度斯生物有限公司總代理;ZH-2自動(dòng)旋渦混合器,天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠生產(chǎn);GZX-9246 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)所用玻璃儀器經(jīng)250℃干烤1 h除去外源性內(nèi)毒素。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定 根據(jù)藥品細(xì)菌內(nèi)毒素限值:L=K/M,K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量,甘草酸二銨注射液內(nèi)毒素的閾劑量K=5.0 EU/（kg?h）;M 為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量,甘草酸二銨注射液的M=0.5 mL/kg（本品人用量為1日1次150 mg、30 mL,取人體平均體重為60 kg）,則甘草酸二銨注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M=5.0 EU/（kg?h）/0.5 mL/（kg?h）=10 EU/mL。

1.2.2 甘草酸二銨注射液最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定 按公式MVD=L/λ,其中L為甘草酸二銨注射液內(nèi)毒素限值（10 EU/mL）;λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度（0.03 EU/mL）,則甘草酸二銨注射液的最大有效稀釋倍數(shù)MVD為333倍。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及可靠性試驗(yàn) 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行2～10倍稀釋,使其最終濃度分別為2.0,0.25,0.03 EU/mL,各取0.1 mL分別加到預(yù)先裝有0.1 mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi),混合均勻,插入設(shè)置好的32通道動(dòng)態(tài)試管儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),其中每一濃度重復(fù)3管,并同時(shí)取0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水加到裝有0.1 mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)作陰性對(duì)照（2管）,當(dāng)對(duì)照管結(jié)果不超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度（0.03 EU/mL）時(shí),用測(cè)得的反應(yīng)時(shí)間（T）對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度（C）對(duì)數(shù)值,即lgT對(duì)lgC進(jìn)行回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表1。

回歸方程:lgT=0.977 607-0.265 876 lgC,|r|=0.997 930,最低標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度為0.03 EU/mL,反應(yīng)時(shí)間474.0～1 449.0 s,陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)間＞3 600 s,在檢測(cè)時(shí)間外,變異系數(shù)CV（%）≤10%,故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性分析

1.2.4 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn) 甘草酸二銨注射液的最大有效稀釋倍數(shù) 333倍 ,本文僅對(duì) 1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 倍 4個(gè)系列濃度進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。方法是將供試品用內(nèi)毒素檢查用水稀釋成 1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 倍 4 個(gè)系列濃度,在每個(gè)濃度下分別取0.1 mL樣品加入0.1 mL鱟試劑作為樣品檢查（NPC）;用對(duì)半互稀釋法（50/50）∶如 0.5 mL S4+0.5 mL E0.5（混勻）→0.1 mL S8E0.25,其中E0.25為標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)濃度,制備各濃度稀釋液的陽(yáng)性對(duì)照樣品,分別取各濃度陽(yáng)性對(duì)照0.1 mL加入0.1 mL鱟試劑作為樣品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）。各濃度樣品及PPC溶液分別平行兩組,插入設(shè)置的動(dòng)態(tài)試管儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),另外還按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線及陰性對(duì)照（NC）,結(jié)果1∶8濃度的樣品,其回收率超過(guò)《中國(guó)藥典》（2005版）規(guī)定,回收率不在50～200%范圍內(nèi),表明有干擾作用。而1∶16、1∶32和1∶64倍系列稀釋濃度樣品回收率均在50～200%范圍內(nèi),且變異系數(shù)（CV）均小于10%,標(biāo)準(zhǔn)曲線|r|≥0.980,NC反應(yīng)時(shí)間＞3 600 s。綜合以上情況,決定采用1∶16、1∶32、1∶64倍稀釋液進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 干擾實(shí)驗(yàn) 為確證 1∶16、1∶32、1∶64倍稀釋液的有效性,進(jìn)行三個(gè)批號(hào)甘草酸二銨注射液（0704072、0707182、0903132）正式干擾試驗(yàn)。其具體操作同1.2.4。結(jié)果見(jiàn)表2。

批號(hào)0704072回歸方程lgT=1.004 681-0.281 457 lgC,|r|=0.998 040;批號(hào)0707182回歸方程lgT=0.799 221-0.325 610 lgC,|r|=0.998 835;批號(hào)0903132回歸方程lgT=0.906 868-0.481 056 lgC,|r|=0.987 902。根據(jù)《中國(guó)藥典》（2005版）規(guī)定,如果藥品陽(yáng)性對(duì)照中內(nèi)毒素的回收率在50～200%范圍之間無(wú)干擾,標(biāo)準(zhǔn)曲線|r|≥0.980,變異系數(shù)（CV%）≤10%,陰性對(duì)照（NC）測(cè)出內(nèi)毒素含量小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度λ（本實(shí)驗(yàn)為0.03 EU/mL）,有效。表2結(jié)果表明:3批供試品在16倍、32倍和64倍稀釋時(shí)均無(wú)干擾作用,可以進(jìn)行定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與結(jié)論

甘草酸二銨注射液1∶8倍稀釋對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查法有干擾,但經(jīng)稀釋后可以消除干擾作用。本實(shí)驗(yàn)3批樣品經(jīng)16倍、32倍和64倍稀釋后,依法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素定量法檢查,其PPC的內(nèi)毒素回收率均在50%～200%,結(jié)果符合藥典規(guī)定。檢測(cè)結(jié)果和其它熱原檢查的結(jié)果一致。證明甘草酸二銨注射液不僅可以用家兔法進(jìn)行熱原檢查,有學(xué)者亦成功用凝膠法進(jìn)行檢查實(shí)驗(yàn),而只要將樣品稀釋成16倍、32倍和64倍稀釋液更可用動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行定量檢查。實(shí)踐證明,動(dòng)態(tài)濁度法是可行的,該法不僅比其它方法靈敏度高,重現(xiàn)性好,更能標(biāo)準(zhǔn)化,迅速得出結(jié)果,能更好的在藥品的生產(chǎn)中全程監(jiān)控藥品的質(zhì)量,值得推廣應(yīng)用。

表2 甘草酸二銨注射液 1∶16、1∶32、1∶64 倍稀釋液的干擾試驗(yàn)結(jié)果

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R285.5

B

1007-4813（2010）01-0016-02

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2009-11-20）