胍基化修飾結(jié)合稀土金屬標(biāo)記應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對定量研究

林虹君,衛(wèi)軍營,賈 偉,張養(yǎng)軍,錢小紅,蔡 耘

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京蛋白質(zhì)組研究中心,蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京 100081)

胍基化修飾結(jié)合稀土金屬標(biāo)記應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對定量研究

林虹君1,衛(wèi)軍營2,賈 偉1,張養(yǎng)軍1,錢小紅1,蔡 耘1

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京蛋白質(zhì)組研究中心,蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京 100081)

稀土金屬元素標(biāo)記技術(shù)利用雙功能試劑二乙三胺五乙酸雙酸酐(DTPA雙酸酐)將稀土金屬元素和目標(biāo)肽段連接起來作為質(zhì)量標(biāo)簽,結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相對定量研究。為進(jìn)一步提高標(biāo)記效率,本研究對反應(yīng)體系溫度、p H值、反應(yīng)時(shí)間和金屬標(biāo)簽過量倍數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化,并結(jié)合胍基化修飾技術(shù)封閉蛋白質(zhì)酶切肽段中的側(cè)鏈ε-氨基,使標(biāo)記反應(yīng)只發(fā)生在末端氨基,提高標(biāo)記選擇性。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所有酶切肽段胍基化反應(yīng)效率均大于95%,且胍基化修飾反應(yīng)對金屬標(biāo)記效率沒有影響。對于選定的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)而言,每個(gè)蛋白質(zhì)都至少有3個(gè)肽段可以得到良好的標(biāo)記結(jié)果。對于離子抑制效應(yīng)帶來的干擾,可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正,結(jié)果表明,當(dāng)兩種金屬離子濃度比小于6時(shí),該效應(yīng)對蛋白質(zhì)相對定量沒有影響。胍基化修飾結(jié)合稀土金屬標(biāo)記方法不僅能在肽段水平實(shí)現(xiàn)相對定量,而且能在蛋白質(zhì)水平實(shí)現(xiàn)相對定量。

稀土金屬標(biāo)簽;胍基化修飾;蛋白質(zhì)定量

隨著人類基因組草圖的初步完成,生命科學(xué)已經(jīng)跨入“蛋白質(zhì)組學(xué)”時(shí)代[1]。蛋白質(zhì)定量是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心內(nèi)容之一,蛋白質(zhì)定量方法包括相對定量和絕對定量:相對定量是指對不同生理病理狀態(tài)下細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)表達(dá)量的相對變化進(jìn)行比較分析;絕對定量是測定細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)組中每種蛋白質(zhì)的絕對量或濃度[2]。

目前蛋白質(zhì)組學(xué)的相對定量方法主要有:基于兩維分離或與熒光標(biāo)記結(jié)合的比較方法,如二維凝膠電泳(2DE)[3-4]和差示熒光二維電泳(DIGE)法[5];基于質(zhì)譜技術(shù)的同一種肽段在不同狀態(tài)下提取的離子流色譜圖比較方法(非標(biāo)記定量);穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法,包括化學(xué)標(biāo)記和代謝標(biāo)記,如18O水標(biāo)記[6-9]、同位素酸酐試劑標(biāo)記、Isobaric tags for relative and absolute quantification(iTRAQ)[10-11]和stable isotope labeling by amino acids in cell culture(SILAC)[12]等。這些方法因存在成本太高,不能用于組織或體液中蛋白質(zhì)的定量分析,不能滿足低濃度、高通量要求等原因,影響了在實(shí)際樣品中的應(yīng)用。為了克服以上缺點(diǎn),近年來發(fā)展了一種新的定量方法,通過雙功能試劑DTPA雙酸酐將稀土金屬元素釔(Y)和鋱(Tb)與肽段結(jié)合后作為質(zhì)量標(biāo)簽[13],利用質(zhì)譜檢測實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的相對定量。該方法穩(wěn)定性好、標(biāo)記試劑廉價(jià)、操作簡單,但存在的問題是,標(biāo)記試劑DTPA雙酸酐對于末端氨基和側(cè)鏈氨基的標(biāo)記無選擇性,在蛋白質(zhì)酶切的肽段中,大量含有側(cè)鏈氨基的肽段將被重復(fù)標(biāo)記,質(zhì)譜檢測中譜圖復(fù)雜化,致使蛋白質(zhì)的定量分析受到干擾[12]。

為了解決這一問題,本研究引入了胍基化修飾[14]對ε-氨基進(jìn)行封閉,即將賴氨酸(Lys)的ε-氨基修飾為高精氨酸(homoarginine),使后續(xù)的反應(yīng)只能發(fā)生在肽段的N端,并且胍基化修飾很完全。引入胍基化修飾之前,稀土金屬定量方法只能對不含ε-氨基的標(biāo)準(zhǔn)肽段或酶切肽段中不含ε-氨基的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量;引入胍基化修飾后,排除了ε-氨基對末端氨基的干擾,使得該定量方法的適用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大,能夠被定量的肽段增加,豐富了同一蛋白質(zhì)的定量信息,從而提高蛋白質(zhì)定量的可信度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

4800 Proteomics Analyzer型基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品;SC100A Speedvac Plus MODUL YOD-230型真空離心干燥機(jī):美國 Thermo Savant公司產(chǎn)品;超純水:由Millipore純水系統(tǒng)制備。

1.2 主要材料與試劑

二乙三胺五乙酸雙酸酐(diethylenetriamine-N,N,N’,N’,N’’-pentaacetic acid dianhydride,DTPA雙酸酐):日本Dojindo公司產(chǎn)品;YCl3,TbCl3,三乙二胺碳酸鹽(triethylammonium bicarbonate,TEAB)和還原劑三羧乙基磷(TCEP):美國Sigma公司產(chǎn)品;碘乙酰氨:比利時(shí) Acros公司產(chǎn)品;乙腈(HPLC級):美國J.T.Baker公司產(chǎn)品;胰蛋白酶(trypsin,sequencing grade)和二硫蘇糖醇(dithiothreithol,DTT):美國 Promega公司產(chǎn)品;乙酸、醋酸銨:北京化工廠產(chǎn)品。

肌紅蛋白(myoglobin)、烯醇化酶(enolase)、胎球蛋白(fetuin)、α-牛奶酪蛋白(α-casein from bovine milk)、β-牛奶酪蛋白(β-casein from bovine milk)、甘油三磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、細(xì)胞色素 C(cytochrome c from house heart)和標(biāo)準(zhǔn)肽段Kemptide(LRRASL G):美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 樣品溶液配制

TEAB:新購溶液為 1 mol·L-1、p H 8.5,用乙酸調(diào)至 0.05 mol·L-1、p H 7.0;醋酸銨:0.1 mol·L-1,p H 6.0;O-甲基異脲溶液:將 O-甲基異脲溶于1 mol·L-1NaOH溶液,最終濃度為1 mol·L-1,p H 11。

1.4 標(biāo)記條件

將標(biāo)準(zhǔn)肽段 Kemptide(0.14 mg)和DTPA雙酸酐(3.26 mg)固體加入到 TEAB溶液(320 μL)中,劇烈渦振1 min,離心樣品至管底,室溫放置0.5～1 h,真空離心干燥,用NH4OAc溶液重新溶解,加入 YCl3,37 ℃螯合 1～2 h,取0.6μL點(diǎn)靶,進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

在基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀上進(jìn)行樣品的質(zhì)譜分析。取5μL處理好的樣本溶液,與飽和的基質(zhì)溶液(5 g·L-1CHCA,溶于含0.1%TFA的50%乙腈中)按照1∶9的比例混合,取0.6μL點(diǎn)靶,空氣中揮發(fā)干燥后,在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)峰高的比值來評估反應(yīng)進(jìn)行的完全程度,從而確定標(biāo)記反應(yīng)的最佳條件。用標(biāo)準(zhǔn)多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜儀的外標(biāo)校正。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用MS-1 kV反射模式,加速電壓20 kV,掃描范圍 m/z 700～3 500,譜圖采集累計(jì)1 500～2 000次。所有質(zhì)譜圖的分析都通過4800 Explorer V 2.0軟件(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 稀土金屬標(biāo)記條件優(yōu)化

因?yàn)椴煌南⊥两饘倬哂胁煌尿铣?shù),該螯合常數(shù)與溫度、反應(yīng)時(shí)間、p H和金屬過量倍數(shù)有關(guān),為了得到最佳螯合率,按照前述條件設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)示于圖1。

從上面的數(shù)據(jù)可以看出,優(yōu)化后的最佳條件為:溫度37 ℃、p H 6、反應(yīng)時(shí)間2 h和金屬離子濃度是肽段的5倍,由此最佳條件得到的質(zhì)譜圖示于圖2。

從圖2可以看出,在條件優(yōu)化后,稀土金屬Y與標(biāo)準(zhǔn)肽段LRRASL G螯合前質(zhì)譜峰為1 148.00,螯合后質(zhì)譜峰為1 233.92,螯合率為69%,多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,此比例穩(wěn)定。用稀土金屬 Tb重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn),螯合率為67%,且螯合率穩(wěn)定。

圖1 反應(yīng)溫度(a)、pH值(b)、反應(yīng)時(shí)間(c)和金屬離子與肽段摩爾比(d)對螯合效率的影響Fig.1 The effect of temperature(a),pH(b),time(c)and mole ratio of metal ion to peptides(d)on chelation rate

圖2 優(yōu)化條件下稀土金屬與標(biāo)準(zhǔn)肽段(LRRASLG)螯合質(zhì)譜圖Fig.2 The MS spectrum of chelate of rare earth metal ion with peptide(LRRASLG)under the optimum condition

2.2 胍基化修飾對ε-氨基封閉

蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)物中大部分肽段都含有ε-氨基,由于DTPA雙酸酐與氨基的結(jié)合沒有選擇性,這樣ε-氨基就會(huì)對定量造成干擾。所以,在進(jìn)行金屬離子螯合之前,必須對ε-氨基進(jìn)行封閉[14]。胍基化修飾的原理是:用化學(xué)試劑 O-甲基異脲修飾Lys的ε-氨基,使Lys的ε-氨基發(fā)生胍基化反應(yīng)生成高精氨酸(homoarginine),質(zhì)量增加42 u,而 O-甲基異脲只專一性地修飾ε-氨基,不會(huì)與N端氨基發(fā)生反應(yīng),反應(yīng)原理示于圖3。

胍基化反應(yīng)的特點(diǎn)是反應(yīng)完全,目的是封閉賴氨酸的ε-氨基,使后續(xù)的反應(yīng)只發(fā)生在肽段的N端。優(yōu)化后的胍基化反應(yīng)條件為:p H 11.0,胍基化試劑濃度100 mmol·L-1,反應(yīng)溫度37℃,反應(yīng)時(shí)間4 h。另外,由于高精氨酸的胍基(p Ka=12.48)比賴氨酸的氨基(p Ka=10.48)有更強(qiáng)的堿性,所以更容易結(jié)合質(zhì)子帶上正電荷,能提高以 K結(jié)尾肽段在MALDI源質(zhì)譜中的信號(hào)強(qiáng)度,修飾前后的質(zhì)譜圖示于圖4。

甘油三磷酸脫氫酶酶切肽段在胍基化修飾前,只有1 763.79和1 820.81豐度較強(qiáng),而胍基化修飾后,無論高豐度峰個(gè)數(shù)和峰整體強(qiáng)度都有明顯提高,示于圖4。可見,胍基化修飾可較大幅度提高以 K結(jié)尾肽段在MALDI源質(zhì)譜中的信號(hào)強(qiáng)度,這對后續(xù)的質(zhì)譜檢測很有幫助。

圖3 胍基化反應(yīng)原理圖Fig.3 The reaction schematic diagram of guanidination

圖4 甘油三磷酸脫氫酶酶切肽段胍基化修飾前(a)和修飾后(b)質(zhì)譜圖Fig.4 The MS spectrum of peptides from glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase before guanidination(a)and after guanidination(b)

標(biāo)準(zhǔn)肌紅蛋白酶切肽段胍基化修飾的結(jié)果表明,除了肽段 ALELFR和 VEADIAGHGQEVLIR因不含ε-氨基而沒有發(fā)生胍基化修飾外,其余酶切肽段胍基化率都大于95%,結(jié)果列于表1。

2.3 在蛋白質(zhì)相對定量中的應(yīng)用

根據(jù)前面優(yōu)化的條件,對肌紅蛋白、烯醇化酶、胎球蛋白、α-牛奶酪蛋白、β-牛奶酪蛋白、甘油三磷酸脫氫酶和細(xì)胞色素C7個(gè)蛋白質(zhì)分別與稀土金屬進(jìn)行螯合實(shí)驗(yàn)。

酶切肽段胍基化修飾后,只剩下末端氨基可以與DTPA雙酸酐結(jié)合,并通過DTPA雙酸酐與 Y螯合,細(xì)胞色素C酶切肽段MIFAGIK與Y螯合的質(zhì)譜圖示于圖5。

從圖5可以看出,細(xì)胞色素C酶切肽段MIFA GIK與稀土金屬 Y螯合后的質(zhì)譜峰為1 283.65,螯合前的質(zhì)譜峰1 196.60已全部消失,螯合率達(dá)到了100%。為了驗(yàn)證此方法對蛋白質(zhì)酶切肽段的普遍適用性,將7個(gè)蛋白質(zhì)做平行實(shí)驗(yàn),重復(fù)性好,每個(gè)蛋白質(zhì)酶切肽段中至少有3個(gè)肽段與稀土金屬的螯合率超過70%,且此比例穩(wěn)定。根據(jù)此3個(gè)肽段完全可以實(shí)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的相對定量,數(shù)據(jù)列于表2。

表1 肌紅蛋白酶切肽段胍基化修飾結(jié)果Table 1 The list of peptides from myoglobin after guanidination

圖5 細(xì)胞色素C酶切肽段MIFAGIK與稀土金屬Y螯合前(a)和螯合后(b)質(zhì)譜圖Fig.5 The MS spectrum of peptide MIFAGIKfrom cytochrome c before(a)and after(b)chelation with rare earth metal Y

表2 7種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)部分酶切肽段胍基化修飾及Y標(biāo)記結(jié)果Table 2 The labeling results of partial peptides from seven standard proteins after guanidination and chelation with rare earth metal Y

對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量,必須在酶切肽段中同時(shí)標(biāo)記一對金屬離子,通過兩者的標(biāo)記差異實(shí)現(xiàn)相對定量。稀土金屬 Tb和 Y與DTPA雙酸酐的穩(wěn)定常數(shù)相近,并且兩者都是單同位素元素,相對分子質(zhì)量相差70 u[13],便于差異質(zhì)譜峰的對比。另外用 Tb重復(fù)了上面 Y元素的所有實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,胍基化率都大于96%,而且與7個(gè)肽段的標(biāo)記效率較好,每個(gè)蛋白質(zhì)酶切肽段中至少有3個(gè)肽段的標(biāo)記率大于70%。所以,Tb可以和 Y作為一對質(zhì)量標(biāo)簽用于蛋白質(zhì)的相對定量。然而,同一溶液中有兩種及兩種以上金屬離子對同一肽段標(biāo)記時(shí),存在金屬離子的抑制現(xiàn)象。為了考察稀土金屬 Tb和 Y的離子抑制效應(yīng),將兩者按1∶1(摩爾比)加入到肌紅蛋白的酶切肽段混合物中,檢測到兩者比例為1.49∶1。

為了驗(yàn)證稀土金屬標(biāo)記方法在蛋白質(zhì)相對定量中應(yīng)用的可行性,對該方法的動(dòng)態(tài)范圍進(jìn)行考察。將肌紅蛋白酶切肽段與稀土金屬 Tb和Y按1∶10、1∶6、1∶3、1∶1、3∶1、6∶1、10∶1(摩爾比)混合,然后進(jìn)行 MALDI-TOF MS分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖6。

圖6 肌紅蛋白酶切肽段A LE LFR與Tb、Y螯合校正曲線Fig.6 The calibration curve of peptide A LE LFRfrom myoglobin chelating withrare earth metals TbandY

由于選用的兩金屬元素與DTPA雙酸酐的結(jié)合常數(shù)分別為 Y(22.05)和 Tb(22.71),兩者的結(jié)合常數(shù)都較大(都大于20),說明兩者與DTPA雙酸酐的結(jié)合能力都很強(qiáng),而兩數(shù)據(jù)又非常相近,意味著在同一體系中兩者的濃度差較大時(shí),容易發(fā)生離子交換,即產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,當(dāng)兩種金屬離子的濃度相差超過6倍以上,由離子抑制帶來的影響較為明顯。所以,為了更加準(zhǔn)確的進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,首先要繪制校正曲線,以便對離子抑制效應(yīng)進(jìn)行校正。

3 結(jié) 論

引入胍基化修飾的稀土金屬標(biāo)記相對定量方法,排除了ε-氨基的干擾,提高了質(zhì)譜峰強(qiáng)度,使其適用范圍擴(kuò)大到蛋白質(zhì)水平,在實(shí)際樣本中應(yīng)用潛力較大。另外,該方法除了用于蛋白質(zhì)相對定量外,還可用于差異蛋白質(zhì)研究,為臨床醫(yī)學(xué)提供了有效途徑;與電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)結(jié)合,可對蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對定量,而ICP-MS具有對極低含量元素實(shí)施精確定量的優(yōu)勢(可達(dá)10-15),這使得該方法在蛋白質(zhì)絕對定量研究中顯示出巨大的潛力。隨著研究的不斷深入和條件的不斷優(yōu)化,該方法一定會(huì)在蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究中發(fā)揮重要的作用。

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Improved Method for Protein Quantification by Using Rare Earth Metal-Chelated Tags after Guanidiation

LIN Hong-jun1,WEI Jun-ying2,J IA Wei1,ZHANG Yang-jun1,QIAN Xiao-hong1,CAI Yun1
(1.State Key L aboratory ofProteomics,Beijing Proteome Research Center,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing102206,China;2.Beijing Institute ofTechnology,Beijing100081,China)

Rare earth metal can be chelated to target peptides by using bicyclic anhydride diethylenetriamine-N,N,N’,N’,N’-pentaacetic acid dianhydride(DTPA dianhydride),which can be used as tags and analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight MS(MALDI-TOF MS)for protein quantification.To further improve the labeling efficiency,reaction temperature,p H value,time and the amount of metal tag were optimized in this study.And for the first time,guanidiation was introduced to make the labeling only take place at theN-terminal of the peptide,thus the selectivity was improved.The resultsshowed that the guanidiation rate of all peptides from standard proteins exceeds 95%,and guanidiation had little influence on the labeling.The results from seven standard proteins showed that at least three peptides of each protein can be stably labeled,and can be used for ideal tags for protein quantification.The interference of ion suppressive effect can be corrected by standard curve,and this suppressive effect has no influence on protein quantification before the ratio of two metal ions reached to 6.The improved strategy provides a technology that can be used in protein quantification not only at the peptide level,but also at the protein level.

rare earth metal-chelated tags;guanylation;protein quantification

O 657.63

A

1004-2997(2010)05-283-08

2010-01-26;

2010-04-15

“973”項(xiàng)目(No.2006CB910801,2006CB910803);“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No.2009ZX09301-002);國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30621063)資助

林虹君(1981～),男(漢族),山東人,助理講師,從事藥物分析研究。E-mail:linhongj@yahoo.com.cn

蔡 耘(1964～),女(漢族),江蘇人,研究員,從事藥物分析研究。E-mail:caiy_2007@yahoo.com.cn