大鼠心肌梗死動(dòng)物模型的制備

王 燕，陳光輝，尹作民，劉為生

(1.山東省青島市中心醫(yī)院＆青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院，青島 266042;2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，北京 100853)

大鼠心肌梗死動(dòng)物模型的制備

王 燕1，陳光輝2，尹作民1，劉為生1

(1.山東省青島市中心醫(yī)院＆青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院，青島 266042;2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，北京 100853)

目的 建立一種穩(wěn)定可重復(fù)的大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型。方法 SD大鼠經(jīng)口氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，開(kāi)胸結(jié)扎冠脈左前降支。術(shù)后28 d行心臟超聲，血流動(dòng)力學(xué)及組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 大鼠術(shù)后存活率60%;手術(shù)組LVEF較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.01);與假手術(shù)組比，手術(shù)組的LVSP明顯下降(P＜0.05)，±dp/dt顯著降低(P＜0.01)，而LVEDP明顯升高(P＜0.01);病理組織學(xué)檢查可見(jiàn)瘢痕形成，纖維組織增生。結(jié)論 本文建立心肌梗死動(dòng)物模型的方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。

心肌梗死;冠狀動(dòng)脈;模型，動(dòng)物;大鼠

在心肌梗死發(fā)病率和死亡率不斷上升，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的今天，成功制備心肌梗死動(dòng)物模型是我們進(jìn)行相關(guān)研究，攻克這一難題的基礎(chǔ)。而且心肌梗死動(dòng)物模型的質(zhì)量及成功率將直接影響到研究的可信度和速度，因此，本研究在綜合以往大鼠心肌梗死模型制作方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和改進(jìn)方法，建立了一種穩(wěn)定、可靠、操作簡(jiǎn)便、成活率高的心肌梗死動(dòng)物模型制作方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

兩月齡雄性 SD大鼠20只，體重250±30 g，由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供［京動(dòng)防(合)字第(04089)號(hào)］。隨機(jī)分為兩組:手術(shù)組10只，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支;假手術(shù)組10只，在相應(yīng)位置穿線，不結(jié)扎。

1.2 研究方法

1.2.1 MI模型的建立:3%水合氯醛按10mL/Kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，將動(dòng)物固定于手術(shù)臺(tái)。心電監(jiān)護(hù)，氣管插管，呼吸機(jī)正壓輔助呼吸，潮氣量10mL/min，吸呼比1∶2，呼吸頻率65次/min。用組織剪手術(shù)區(qū)域剪毛，2%碘伏消毒局部皮膚三遍，75%酒精脫碘，戴無(wú)菌手套。于大鼠左側(cè)第四肋間橫切口開(kāi)胸，組織剪剪斷上緣肋骨，充分暴露心臟，自制小拉鉤固定。小心剪開(kāi)心包，參照 Olivette的方法［1］，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間下方1～2mm處用6－0無(wú)損傷線結(jié)扎冠脈左前降支及一小束心肌，心電圖示V1～V5胸前導(dǎo)聯(lián)ST段弓背或水平抬高，左心室前壁顏色變白為成功的標(biāo)志。逐層縫合胸壁肌肉及皮膚。腹腔注射青霉素，呼吸機(jī)輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù)，送回籠中喂養(yǎng)。

1.2.2 心臟超聲檢查:固定超聲工作人員，單盲控制。心臟探頭14V3，頻率6 Hz。經(jīng)左側(cè)胸壁，左室長(zhǎng)軸、短軸切面觀察室壁運(yùn)動(dòng)情況。在長(zhǎng)軸切面左心室乳頭肌水平，M型超聲測(cè)量三個(gè)心動(dòng)周期的左心室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)及左心室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)，并各取其均值。以機(jī)器內(nèi)置的Teich公式計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。動(dòng)物于術(shù)前及術(shù)后28 d進(jìn)行心臟超聲檢查，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)左心功能測(cè)定:冠脈結(jié)扎術(shù)后4周，3%水合氯醛腹腔注射再次麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺(tái)。復(fù)查12導(dǎo)聯(lián)心電圖。直徑約2mm的動(dòng)脈導(dǎo)管聯(lián)接壓力感受器及多導(dǎo)生理記錄儀，肝素鹽水排凈氣泡，檢查動(dòng)脈導(dǎo)管是否暢通及壓力感受器是否敏感。將壓力感受器探頭置于與大鼠左心房同一水平，進(jìn)行調(diào)零。用組織剪手術(shù)區(qū)域剪毛，2%碘伏消毒局部皮膚三遍，75%酒精脫碘，戴無(wú)菌手套。頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈導(dǎo)管夾閉近心端。眼科剪在頸總動(dòng)脈壁上剪開(kāi)一小口，沿頸總動(dòng)脈插入導(dǎo)管，放開(kāi)動(dòng)脈夾，將導(dǎo)管插至左心室，連續(xù)記錄左心室收縮壓(LVSP)、舒張末壓(LVEDP)和左心室內(nèi)壓上升下降最大速率(±dp/dt)。并同步記錄心率。

1.2.4 心臟標(biāo)本的處理及HE染色:完成上述血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后，經(jīng)左心室導(dǎo)管放血處死動(dòng)物。立即開(kāi)胸，取出心臟，PBS沖洗血液，10%中性福爾馬林固定。1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋，切片。各取一張5 μm的切片做HE染色。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存情況

手術(shù)組于術(shù)中出現(xiàn)心律失常及急性左心衰死亡1只，術(shù)后死于慢性充血性心力衰竭1只，死于麻醉1只，進(jìn)行心臟超聲檢查時(shí)死亡1只，存活率60%;假手術(shù)組術(shù)中死于急性心律失常1只，術(shù)后無(wú)死亡，存活率90%。兩組存活率有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 心電圖改變情況

圖1 冠脈結(jié)扎后大鼠心電圖改變Fig.1 ECG change after coronary atery ligated

手術(shù)組結(jié)扎冠脈左前降支后，立即出現(xiàn)胸前導(dǎo)聯(lián)V1～V6ST段水平或弓背上抬，下壁導(dǎo)聯(lián)Ⅱ、Ⅲ、aVF ST段水平壓低(圖1)。

2.3 心臟超聲檢查改變情況

術(shù)后28 d心臟超聲檢查可見(jiàn)左心室前壁運(yùn)動(dòng)減弱，與后壁心肌呈同向運(yùn)動(dòng)(圖2，見(jiàn)彩插6);左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低(表1)。

表1 冠脈結(jié)扎前后超聲檢查心功能改變Tab.1 Change of heart function through echocardiogram after coronary atery ligated

2.4 血流動(dòng)力學(xué)改變情況

術(shù)后28 d，與假手術(shù)組比，手術(shù)組的LVSP明顯下降(P＜0.05)，±dp/dt顯著降低(P＜0.01)，而LVEDP明顯升高(P＜0.01)(表2)。

表2 冠脈結(jié)扎前后血流動(dòng)力學(xué)改變情況Tab.2 Change of haemodynamics after coronary atery ligated

2.5 心肌組織HE染色

假手術(shù)大鼠心肌細(xì)胞橫紋及閏盤(pán)清晰，纖維結(jié)構(gòu)清楚、排列整齊;冠脈結(jié)扎術(shù)后4周，心臟大體標(biāo)本可見(jiàn)瘢痕形成，心臟前壁塌陷，室壁變薄。病理切片顯示心肌纖維排列紊亂，核溶解，甚至心肌細(xì)胞消失，形成膠原纖維組織(圖3，見(jiàn)彩插6)。

3 討論

隨著心肌梗死發(fā)病率的升高，用于心肌梗死基礎(chǔ)研究的動(dòng)物模型的需求量也不斷增加。建立可靠的心肌梗死動(dòng)物模型是保證試驗(yàn)順利進(jìn)行的第一步，心肌梗死動(dòng)物模型的制作也成為心血管內(nèi)科研究人員一項(xiàng)基本的操作技術(shù)［2］。

目前常用于復(fù)制心肌梗死模型所選用的動(dòng)物，大多用哺乳動(dòng)物，如犬、兔、小牛、豬、豚鼠、大鼠等。靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物狒狒、猴子當(dāng)然有其他動(dòng)物不可比擬的優(yōu)越性，但其材料難得，不易普通使用。犬的體積大小適中，性情溫順易于訓(xùn)練。但犬的冠狀血管結(jié)構(gòu)和人相比，有較大差異，尤其是犬冠狀動(dòng)脈變異多，側(cè)支吻合豐富，室間隔動(dòng)脈特別發(fā)達(dá)等，常使心肌梗死的面積不易控制。豬冠狀循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)酷似人類(lèi)，但易發(fā)生急性心律失常，模型成活率較低。另外，犬、豬都存在成本較高，飼養(yǎng)不便的缺點(diǎn)。故近年來(lái)轉(zhuǎn)而多用兔、鼠等小動(dòng)物。用大鼠制造心肌梗死的方法，經(jīng)簡(jiǎn)化、改進(jìn)而趨于成熟，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已普遍使用。

在大鼠心梗模型制作方法上，有多種方案可供選擇，各有利弊，也因人而異。目前國(guó)內(nèi)外常用的方法有:(1)藥物法:多采用兒茶酚胺或垂體后葉素等收縮冠狀動(dòng)脈的藥物，進(jìn)行皮下或腹腔注射［3］。這種方法操作簡(jiǎn)便，成活率高，但心肌梗死的面積不能控制。(2)冰凍法:采用在液氮中低溫冷凍的金屬片在大鼠左心室游離壁反復(fù)冷凍直至壞死［4］。這種方法易于掌握，心梗面積也相對(duì)恒定，但不易形成透壁心梗，與心肌梗死的自然過(guò)程存在差異。(3)冠脈阻斷法:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈是制作心肌梗死動(dòng)物模型最常用的方法。國(guó)外有采用Jons法［5］，乙醚麻醉，在自主呼吸條件下，不用呼吸機(jī)輔助呼吸，迅速開(kāi)胸?cái)D出心臟進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎。這種方法所需時(shí)間短，動(dòng)物麻醉淺，易于蘇醒，但技術(shù)難度高，須經(jīng)反復(fù)練習(xí)才能掌握。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，我們參照Olivette的方法，應(yīng)用呼吸機(jī)輔助呼吸，撐開(kāi)胸壁進(jìn)行冠脈結(jié)扎，不僅易于掌握，也提高了模型的質(zhì)量和成活率。

應(yīng)用呼吸機(jī)氣道建立上，也有面罩呼吸、氣管插管、氣管切開(kāi)等多種方法可供選擇。面罩呼吸最為簡(jiǎn)單，但通氣量往往不足，氣體也容易誤吸入消化道，效果不理想。氣管切開(kāi)操作也相對(duì)簡(jiǎn)單，且通氣確切，但術(shù)中術(shù)后氣道分泌物較多，不易護(hù)理，容易造成氣道感染，在某種程度上提高了術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病率和動(dòng)物的死亡率。因此，我們采用了氣管插管的方法進(jìn)行通氣。雖然這種方法需要一些技巧，但對(duì)動(dòng)物氣道損傷小，術(shù)后恢復(fù)較好。主要要點(diǎn)如下:(1)保證動(dòng)物麻醉較深。麻醉較淺的動(dòng)物在導(dǎo)管插入時(shí)，嘔吐反射較強(qiáng)，難以成功。以鉗夾大鼠四肢末端，其反應(yīng)較弱或無(wú)掙扎反應(yīng)為宜。(2)提起大鼠舌頭，盡量沿舌根插入導(dǎo)管，并且會(huì)有輕微突破感，繼續(xù)插入會(huì)感到氣管環(huán)的頓錯(cuò)感。否則極可能誤插入食道。(3)速度要快。在大鼠發(fā)生嘔吐反射前插入，否則導(dǎo)管因大鼠嘔吐易進(jìn)入食管。(4)在不確定導(dǎo)管位置時(shí)，可對(duì)大鼠進(jìn)行試通氣，若大鼠自主呼吸消失，呼吸加深，頻率與呼吸機(jī)通氣頻率一致，且為胸式呼吸時(shí)，可確定氣管插管成功;若試通氣時(shí)，大鼠仍有自主呼吸，且呼吸頻率加快，伴有腹部漸膨隆，則氣管插管位于食道內(nèi)，應(yīng)立即拔管重插。

另外，在麻醉方法上，有戊巴比妥，硫噴妥鈉，氯胺酮，乙醚，水合氯醛等可以選擇。戊巴比妥麻醉效果好，麻醉時(shí)間長(zhǎng)，利于手術(shù)操作，但存在術(shù)后蘇醒遲的缺點(diǎn)。硫噴妥鈉、氯胺酮、乙醚作用時(shí)間短，利于術(shù)后恢復(fù)，但麻醉效果差，同時(shí)乙醚用時(shí)要注意個(gè)人防護(hù)及煙火。本實(shí)驗(yàn)體會(huì)水合氯醛腹腔注射麻醉效果好，時(shí)間適宜，操作簡(jiǎn)便，利于動(dòng)物的術(shù)后恢復(fù)。

手術(shù)結(jié)扎的具體部位需經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，以期達(dá)到統(tǒng)一心梗面積的模型。我們的體會(huì)是:盡量固定在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐之間進(jìn)行結(jié)扎，并結(jié)合心電圖胸前導(dǎo)聯(lián)V1～V6ST段的上抬，能達(dá)到理想的效果。若結(jié)扎位置偏高，則動(dòng)物易發(fā)生急性心律失常而死亡率大大上升;若結(jié)扎位置偏低，則心梗面積較小，在心功能的指標(biāo)上則表現(xiàn)不明確。

在心衰程度的評(píng)價(jià)上，近年來(lái)，隨著對(duì)心衰研究的深入，心鈉素(ANP)和腦鈉素(BNP)［6，7］在心衰程度的評(píng)價(jià)上越來(lái)越受到重視。本實(shí)驗(yàn)所采用的心臟超聲檢查及血流動(dòng)力學(xué)檢查略顯粗糙。

總之，通過(guò)我們對(duì)麻醉方法、氣道建立及結(jié)扎位置的摸索和改進(jìn)，基本建立了一種能較理想模擬臨床冠心?。墓＃乃ゲ〕痰膭?dòng)物模型。并且操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，模型可穩(wěn)定復(fù)制，可以在心肌梗死的進(jìn)一步研究中發(fā)揮作用。

［1］Olivetti G，Capasso JM，Meggs LG，et al.Cellular basis of chronic ventricular remodeling after myocardial infarction in rats［J］.Circ Res，1991，68:856－869.

［2］劉尊齊，崔連群，蓋玉生.大鼠急性心肌梗死模型的制備［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，7(9)34－35.

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Establishment of a Rat Experimental Model of Acute Myocardial Infarction

WANG Yan1，CHEN Guang－h(huán)ui2，YIN Zuo－min1，LIU Wei－sheng1
(1.Qingdao Central Hospital＆ Second Facilitated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266042，China;2.Laboratory of Cardiology，China PLA General Hospital，Beijing 100853，China)

Objective To develop a steady and reproducible myocardial infarction(MI)model in rats.Methods SD rats were endotracheal incubated through mouth and ventilator－assisted breathing，the left anterior descending coronary artery was ligated.Echocardiogram，haemodynamics and histopathology were detected twenty－eight days after ligation.Results Survival rate of the rat model was 60%.LVEF of the AMI group decreased significantly(P＜0.01).Compared with the sham group，LVSP and ±dp/dt of the AMI group decreased significantly(P＜0.05，P＜0.01)，but the LVEDP of the AMI rat increased significantly(P＜0.01).Histopathology study could seen the scar and the proliferation of the fibrous tissue.Conclusions This experiment provids an easy way to establish the MI model，which is reproducible and credible.

Myocardial infarction;Coronary artery;Model，animal;Rat

R332

B

1671－7856(2010)06－0054－04

2009－12－23

圖2 冠脈結(jié)扎前后大鼠心臟M型超聲改變情況
Fig.2 Echocardiogram change after coronary atery ligated

圖3 冠脈結(jié)扎后大鼠心臟病理變化
Fig.3 Histopathology after coronary atery ligated

注：A: 急性心肌梗死后4周心臟大體標(biāo)本，B: 梗死心臟橫切面，C: 梗死心肌病理切片，D: 正常心肌病理切片。
Note: A: the heart of acute myocardial infarction for 4 Weeks; B: the across-section of the infarcted heart; C: the pathology of infarcted heart（×200）; D: the pathology of normal heart（×200）.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30471924)。

王燕。E－mail:wangyan94142@sina.com.cn