香薷多糖的乙醇分級(jí)純化及其性質(zhì)

李卷梅，聶少平*，李景恩，李 昌，謝明勇

香薷多糖的乙醇分級(jí)純化及其性質(zhì)

李卷梅，聶少平*，李景恩，李 昌，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

采用熱水浸提法從香薷中得到多糖提取物，然后采用乙醇分級(jí)沉淀法純化香薷多糖，收集得到乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%條件下析出的多糖沉淀物。之后經(jīng)Sevag法脫除多糖中的游離蛋白，得到純化后的6個(gè)香薷多糖組分HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6。應(yīng)用紫外和紅外光譜檢測(cè)HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的光譜性質(zhì)，測(cè)定糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和糖醛酸含量，并用氣相色譜法測(cè)定單糖組成。結(jié)果表明：HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6均為酸性多糖，蛋白含量較高。HMP-1和HMP-2主要含有阿拉伯糖和葡萄糖，HMP-3主要含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和核糖，HMP-4主要含有阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，HMP-5和HMP-6主要含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。此外，6個(gè)多糖組分均含有少量的鼠李糖、木糖，但單糖間物質(zhì)的量比相差較大。

香薷多糖；乙醇分級(jí)沉淀；理化性質(zhì)；光譜性質(zhì)；單糖組成

香薷(Herba Moslae)為傳統(tǒng)的辛溫解表中藥，被衛(wèi)生部列為藥食兩用資源目錄之中，全草能發(fā)汗解表，利水消腫，調(diào)中溫胃止嘔，最早記載于《名醫(yī)別錄》，列為中品，又名香柔[1]。香薷屬多年生草本，在我國分布廣泛，全國香薷類商品藥材主要為“江香薷”和“青香薷”[2]。過去香薷的化學(xué)成分研究?jī)H限于揮發(fā)油成分，其揮發(fā)油具有解熱、陣痛、免疫增強(qiáng)、抗菌及抗病毒作用[3]。

江香薷是江西的地道藥材，栽培歷史悠久，主要分布于新余市、樟樹市、分宜縣、渝水區(qū)等地。目前國內(nèi)外對(duì)香薷多糖的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)對(duì)從江西樟樹產(chǎn)的江香薷用熱水浸提得到香薷多糖，采用乙醇分級(jí)沉淀法進(jìn)行純化得到不同多糖組分，測(cè)定其糖含量、可溶性蛋白含量以及糖醛酸含量，結(jié)合紫外、紅外光譜考察其光譜性質(zhì)，并用氣相色譜法分析其單糖組成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香薷采自江西省樟樹市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為唇形科植物江香薷，粉碎后過20目篩。

D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖和L-巖藻糖 上海國藥試劑公司；牛血清白蛋白 Amersco公司；考馬斯亮藍(lán)G-250(進(jìn)口分裝) Fluka公司；濃硫酸、無水乙醇、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、乙酸酐、吡啶、咔唑、苯酚、鹽酸羥胺、葡萄糖等均為國產(chǎn)分析純。1.2儀器與設(shè)備

ALPHA 1-2 冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；GC(6890N) 美國Agilent Technologies公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Nicolet FT-IR 5700型傅里葉紅外光譜儀 Thermo Electron 公司；AL 104電子天平 上海梅特勒-托利儀器公司；EYELAN-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；SHZ-ⅢB循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化有限公司；TDL-5型離心沉淀機(jī) 上海飛鴿系列離心機(jī)廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海國華電器有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；透析袋(8000～10000D)美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 香薷多糖水提物的制備

稱取已粉碎過篩的香薷100g，用800mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇浸泡24h脫除脂溶性物質(zhì)，雙層濾布過濾。濾渣置于50℃烘箱中揮干乙醇[4]。干燥后，加1500mL蒸餾水，于87℃水浴回流提取4h[5]，4800r/min離心分離10min，雙層濾布過濾。濾渣重復(fù)提取一次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到香薷多糖水提物。

1.3.2 香薷多糖的乙醇分級(jí)沉淀

將多糖水提物依次用體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇于4℃層析冷柜中分級(jí)沉淀12h，離心，沉淀用無水乙醇洗滌兩次。自然風(fēng)干乙醇后，用Sevag法[6](氯仿與正丁醇體積比為4:1)脫蛋白，反復(fù)進(jìn)行兩次。然后用流動(dòng)自來水透析48h，蒸餾水透析24h[7]，透析液濃縮后冷凍干燥得香薷多糖組分(HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6)，備用。

1.3.3 基本理化指標(biāo)測(cè)定

以鼠李糖為標(biāo)準(zhǔn)，苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[8]；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[9]；以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)，硫酸-咔唑法測(cè)定糖醛酸含量[10]。

1.3.4 紫外光譜分析

將質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的多糖樣品溶液置于紫外-可見分光光度計(jì)中于190～400nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行光譜掃描[11]。

1.3.5 紅外光譜分析

稱取干燥樣品1mg，與約100mg KBr研磨后，KBr封閉樣品顆粒，制成透明壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000cm-1區(qū)內(nèi)進(jìn)行光譜掃描[12]。

1.3.6 單糖組成分析

稱取10mg樣品于安培管中，加入2mL濃度為2mol/L的三氟乙酸，真空封管，100℃下水解8h[13]。水解后，樣品冷卻至室溫，于70℃水浴用氮?dú)獯蹈扇宜?，得到多糖水解物?/p>

稱取8種標(biāo)準(zhǔn)單糖(鼠李糖、核糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)各2mg于樣品管中，加入10mg鹽酸羥胺，0.5mL吡啶溶解。加塞，于90℃恒溫水浴振蕩30min。冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐。加塞，于90℃恒溫水浴振蕩30min[14]。冷卻至室溫，用有機(jī)膜過濾，得到糖腈乙酸酯衍生物。將多糖水解物按照相同方法進(jìn)行衍生。氣相色譜儀工作參數(shù)見表1。

表1 氣相色譜儀工作參數(shù)Table 1 GC instrumental parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標(biāo)測(cè)定

由表2可知，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的糖含量均不高，最多為43.06%，最少為28.72%。HMP-2的糖醛酸含量最高，達(dá)到51.71%；HMP-5的糖醛酸含量最低，只有9.44%。除HMP-6，其余5個(gè)多糖組分的蛋白質(zhì)含量均在11%～20%之間。由于用Sevag法基本脫除了游離蛋白，所以樣品中的蛋白質(zhì)應(yīng)為與多糖結(jié)合緊密的結(jié)合蛋白。HMP-2是得率最高的多糖組分，其中的雜質(zhì)較少，糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)三者加起來含量超過96%。HMP-3的得率其次，其雜質(zhì)含量也較少。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將對(duì)HMP-2和HMP-3這兩個(gè)組分進(jìn)行深入分析。其余組分的雜質(zhì)較多，考慮為灰分和結(jié)合水。

表2 HMP化學(xué)組成分析Table 2 Chemical composition analysis of HMP-1 through 6

2.2 紫外光譜掃描

圖1 HMP紫外可見掃描光譜Fig.1 UV absorption spectra of HMP-1 through 6

由圖1可知，6種多糖在260nm波長(zhǎng)處均沒有吸收峰，說明不含核酸成分；在280nm波長(zhǎng)處略有吸收，且從HMP-1至HMP-6，280nm波長(zhǎng)處吸收程度逐漸增大，這與用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)得的蛋白含量趨勢(shì)一致。2.3紅外光譜掃描

圖2 HMP-1、HMP-2、HMP-3紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of HMP-1, 2 and 3

圖3 HMP-4、HMP-5、HMP-6紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of HMP-4, 5 and 6

紅外光譜可以進(jìn)行一些復(fù)雜化合物的定性及定量分析，檢驗(yàn)分子中一些官能團(tuán)和氫鍵的存在。紅外光譜法不破壞樣品，這對(duì)于極難獲得的糖的微量樣品尤為重要[15]。6種多糖的紅外掃描結(jié)果見圖2、3。

在3400cm-1左右出現(xiàn)的寬峰為羥基的O－H伸縮振動(dòng)或氨基的N－H伸縮振動(dòng)[16]，O－H伸縮振動(dòng)和N－H伸縮振動(dòng)往往相互疊加，難以區(qū)分。若為O－H伸縮振動(dòng)，則當(dāng)部分羥基被取代時(shí)，該峰會(huì)減弱[15]。從HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6分別在3384.2、3419.4、3418.4、3421.0、3374.5、3381.0cm-1的吸收強(qiáng)度可以看出，HMP-1和HMP-6的羥基較多，其余4個(gè)組分的羥基較少。在2923cm-1附近(2927.9、2930.9、2932.3、2930.2、2930.1、2941.7cm-1)出現(xiàn)的弱吸收峰為糖環(huán)中的C－H伸縮振動(dòng)[17]。1400～1200cm-1之間的吸收峰是糖類化合物的C－H變角振動(dòng)。由此可以初步判定，6個(gè)組分均為多糖。

1650～1500cm-1之間的吸收峰是氨基的N－H變角振動(dòng)[15]，由此證明6種多糖應(yīng)該含有蛋白質(zhì)。對(duì)于HMP-5和HMP-6，在1650～1500cm-1區(qū)域比其他組分多一個(gè)吸收峰，這可能由于其蛋白質(zhì)含量較高引起。鑒于6種多糖在1650～1620cm-1之間均沒有吸收峰，因此它們應(yīng)該不含有酰胺基。

在1410cm-1左右出現(xiàn)的吸收峰為羧基的C－O伸縮振動(dòng)，在1320～1210cm-1之間的一組吸收峰為羧基的O－H變角振動(dòng)[15]，由此可以判斷6種多糖含有羧基。值得注意的是，HMP-2在1741.1cm-1處有一吸收峰，這可能為乙酰酯基或醛基的C=O伸縮振動(dòng)，而在之前的化學(xué)組成測(cè)定中發(fā)現(xiàn)HMP-2的糖醛酸含量最高，因此為醛基的C=O伸縮振動(dòng)的可能性更大。

1200～950cm-1區(qū)域內(nèi)比較大的吸收峰是由兩種C－O伸縮振動(dòng)引起的，一種是屬于C－O－H的，另一種是屬于糖環(huán)C－O－C的[18]。HMP-1在1151.1cm-1和1026.7cm-1處的兩個(gè)吸收峰可能為果膠的吸收峰，而根據(jù)HMP-2在1741.1、1619.1、1103.0、1016.6cm-14處的吸收峰判斷該組分極有可能含有果膠[19]，這符合之前的糖醛酸測(cè)定結(jié)果。

HMP-1和HMP-2同時(shí)在767cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是由對(duì)稱吡喃環(huán)的伸縮振動(dòng)引起；HMP-2和HMP-3分別在910.4、906.8cm-1處的吸收峰應(yīng)該是β-D-半乳吡喃糖的特征吸收；HMP-2在832.5cm-1處的峰可能是α-甘露吡喃糖或者β-阿拉伯吡喃糖的特征吸收；HMP-3在819.2cm-1處的峰可能是α-甘露吡喃糖的特征吸收或者呋喃環(huán)的C－H變角振動(dòng)；HMP-4在898.8cm-1處的峰是β-D-甘露吡喃糖的特征吸收；HMP-5和HMP-6分別在782.3、807.8cm-1處的吸收峰應(yīng)該為呋喃環(huán)的C－H變角振動(dòng)[15]；HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-5和HMP-6在600cm-1附近的一組峰為O－H的面外振動(dòng)[20]。

2.4 單糖組成

標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的氣相色譜圖見圖4，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的單糖組成見表3。從圖4可以看出，除巖藻糖衍生物和阿拉伯糖衍生物沒有完全分離外，其他6種單糖衍生物得到較好分離。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的氣相色譜圖Fig.4 GC chromatogram of monosaccharide standard derivatives

3 結(jié) 論

本研究首次用乙醇分級(jí)沉淀的方法純化香薷多糖并研究其理化性質(zhì)。結(jié)果表明：HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6糖含量中等，均有一定量的糖醛酸和蛋白質(zhì)，這與光譜分析結(jié)果一致。氣相色譜分析表明，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6主要含有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖，此外還有少量的甘露糖、木糖、鼠李糖和核糖。

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Ethanol Fractional Precipitation and Characterization of Polysaccharides from Herba Moslae

LI Juan-mei，NIE Shao-ping*，LI Jing-en，LI Chang，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

A polysaccharide-rich extract was obtained from Herba Moslae by hot water extraction and purified by fractional precipitation with gradient concentrations of ethanol (20%, 30%, 40%, 50%, 60% and 70%). The separated fractions were deproteinized by Sevag method and six purified polysaccharide fractions, named HMP-1 through 6 were obtained. These fractions were subjected to UV-visible spectral analysis, the determination of sugar, soluble protein and uronic acid contents and monosaccharide composition analysis by gas chromatography (GC). Each of these fractions was an acidic polysaccharide, with high protein content. Arabinose and glucose were the main monosaccharides in HMP-1 and HMP-2, arabinose, glucose, galactose and ribose were the main monosaccharides in HMP-3, arabinose, glucose and galactose were the main monosaccharides in HMP-4, and arabinose, glucose, galactose and mannose were the main monosaccharides in HMP-5 and HMP-6. In addition, small amounts of rhamnose and xylose were also detected in each of the six fractions.

polysaccharides from Herba Moslae；ethanol fractional precipitation；physico-chemical properties；spectral properties；monosaccharide composition

TQ929.2

A

1002-6630(2010)19-0182-04

2010-06-27

食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200806)；江西省青年科學(xué)家井岡之星；遠(yuǎn)航工程項(xiàng)目

李卷梅(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：lijuanmei_ncu@hotmail.com

*通信作者：聶少平(1978—)，男，副教授，博士，主要從事食品科學(xué)與工程、食品營(yíng)養(yǎng)與安全及糖化學(xué)與糖生物學(xué)研究。E-mail：spnie@ncu.edu.cn