高產(chǎn)γ-氨基丁酸的富鋅乳酸菌培養(yǎng)基優(yōu)化及gad基因的克隆和序列分析

謝曉陽，陳 瑤，劉志文，郭曉燕，程 新，高小玉，徐 波*

高產(chǎn)γ-氨基丁酸的富鋅乳酸菌培養(yǎng)基優(yōu)化及gad基因的克隆和序列分析

謝曉陽，陳 瑤，劉志文，郭曉燕，程 新，高小玉，徐 波*

(南昌市發(fā)酵應用技術重點實驗室，江西農業(yè)大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045)

為了檢測和提高乳酸菌γ-氨基丁酸(GABA)產(chǎn)量，本研究采用紙層析預染法分析Lactobacillus brevis BS2最佳發(fā)酵產(chǎn)GABA條件為：pH5.0，以葡萄糖為碳源，以大豆蛋白胨和牛肉膏為復合氮源，碳氮比為1:1，底物質量分數(shù)1%，GABA產(chǎn)量可達到6.32g/L。采用CTAB法提取該菌株基因組，并以此基因組為模板應用降落PCR擴增出1407bp的谷氨酸脫羧酶基因gad，將gad克隆到T載體后經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)與L. brevis strain BH2 的gad具有高度的同源性，同源性達98%，證明該菌株為高產(chǎn)GABA的富鋅短小乳酸桿菌，在工業(yè)應用方面具有很大潛力。

γ-氨基丁酸；Lactobacillus brevis BS2；谷氨酸脫羧酶基因；培養(yǎng)基優(yōu)化；序列分析

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)廣泛分布于從單細胞生物到哺乳動物的各種有機體活細胞中[1]，為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種主要的抑制性神經(jīng)遞質[2]，具有許多重要的生理功能如降血壓、利尿、鎮(zhèn)痛安神、改善腦機能、提高記憶力、改善更年期綜合癥等，當大腦長期缺乏GABA時將會導致癲癇、帕金森等疾病，因此，GABA已成為重要的功能性因子，在醫(yī)藥、食品保健、化工及農業(yè)等行業(yè)都將具有廣泛運用[3-5]。GABA的制備方法有化學合成法和生物轉化法?；瘜W合成法副產(chǎn)物多，難以純化，生產(chǎn)成本高，安全性差，而微生物發(fā)酵法具有安全、成本低、速度快、培養(yǎng)簡單、分布廣等特點，在食品工業(yè)和醫(yī)藥中得到廣泛應用，尤其是利用公認的安全性(generally regarded as safe，GRAS)的益生菌——乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)進行生產(chǎn)GABA具有更廣闊的前景[5-8]。

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD；EC4.1.1.15)是生物催化L-谷氨酸α-羧基脫羧反應生成非蛋白質組成的天然氨基酸GABA的唯一酶，利用乳酸菌等益生菌中的GAD催化谷氨酸生產(chǎn)GABA，或將產(chǎn)GABA的乳酸菌直接應用于食品，可不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有顯著的優(yōu)點。目前已有很多研究表明乳酸菌具有產(chǎn)GAD能力，可催化谷氨酸脫羧產(chǎn)生GABA[9]。

為了檢測和提高利用乳酸菌生產(chǎn)GABA的產(chǎn)量，本實驗采用紙層析預染法檢測前期篩選的產(chǎn)GABA的富鋅短小乳桿菌的GABA產(chǎn)量[10]，并以菌株基因組為模板應用PCR方法擴增出谷氨酸脫羧酶基因gad，測序后進行同源性比較，為構建高效表達gad的乳酸菌工程菌菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

短小乳酸桿菌(Lactobacillus brevis BS2) 江西農業(yè)大學生物科學與工程學院分子生物學實驗室分離并保存[10]；pGEM-T載體 Promega公司。

溶菌酶、變容菌素、蛋白酶K、Rnase、Taq DNA聚合酶、dNTP、Ampicillin 上海生工生物工程服務有限公司；X-gal、IPTG、T4DNA連接酶 Promega公司；質粒小量提取試劑盒、DNA回收試劑盒 Tiangen生化科技(北京)有限公司。

WD-9403E型紫外分析儀、peetrAA-10型原子吸收分光光度計、DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；TGL-16G型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；DNA基因擴增儀 德國Biometra公司；1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 培養(yǎng)基與常用溶液

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、K2HPO42g、檸檬酸三銨2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫-80 lmL、MgSO4·7 H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、H2O 1000mL、pH6.2～6.4，121℃ 高壓滅菌20min；MRSG培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中加入0.5%～2%谷氨酸鈉。

TE緩沖液、裂解緩沖液、CATB緩沖液和醋酸鈉緩沖液的配制見文獻[6]。

1.3 方法

1.3.1 紙層析預染方法[11]

取1mL菌液5000r/min離心10min，吸取0.5μL上清液點樣于濾紙上，直接將層析紙用含1.2%茚三酮的展開劑(正丁醇、冰乙酸、水體積比5:3:2)進行展開后70℃顯色80min，將GABA斑點剪下于洗脫液(75%乙醇、0.6% CuSO4·5H2O 體積比38:2) 中40℃、50r/min洗脫，測定洗脫液OD512nm定量分析GABA。

1.3.2 繪制標準曲線

配制0.5、1.5、3、4、5.5、6.5、8、9、10.5g/L質量濃度梯度的GABA標準品溶液，通過紙層析預染方法定量分析，以GABA的質量濃度為橫坐標，A512nm為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)基上生長良好的菌株接入50mL培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)1d；發(fā)酵培養(yǎng)：上述產(chǎn)GABA的乳酸菌菌株經(jīng)活化后，以1%的接種量接種到MRSG培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3d；檢測底物不同添加量對GABA產(chǎn)量的影響時，培養(yǎng)基中添加的底物谷氨酸鈉質量分數(shù)分別為1%、2%、3%、4%和5%。

1.3.4 乳酸菌基因組DNA提取

采用CTAB法[12]。

1.3.5 菌種16S rRNA鑒定

將提取的乳酸菌基因組送交上海生工生物工程服務有限公司測序16S rRNA，根據(jù)得到的結果與Genbank中相關序列進行同源性比較。

1.3.6 引物設計

搜索http://www.pubmed.com的Genbank中與乳酸菌相關的gad序列，找出gad的保守序列以供參考[13]。在此基礎上，確定L. brevis strain BH2的gad序列(GenBank EU084998.1)為最佳參考序列，采用Oligo 7.0軟件設計引物，引物由上海生工生物工程服務有限公司合成，采用GC%計算退火溫度。上游引物：gadup：5＇- AATC CATGGATGGCTATGTTGTATGGAAAACACC-3＇(NcoI)；下游引物：gadlow：5＇-ACAAAGCTTTTAGT GCGTGAACCCGTATTTTTTA-3＇(HindⅢ)。

1.3.7 降落PCR擴增gad

以乳酸菌基因組為模板，以gadup、gadlow為上、下游引物，采用降落PCR擴增gad。50μL PCR反應體系包含：10×Buffer 5.0μL、2.0mmol/L dNTP 4.0μL、上游引物gadup 2.0μL、下游引物gadlow 2.0μL、25mmol/L MgCl26.0μL、1U/μL Taq酶 2.0μL、基因組模板2.0μL、ddH2O 27μL。反應程序為：95℃預變性5min，95℃1min、60℃ 1min、72℃ 90s、4 個循環(huán)；95℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 90s，4個循環(huán)；95℃ 1min、56℃1min、72℃ 90s、4個循環(huán)；95℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 90s、25個循環(huán)；72℃ 30min，4℃保存；1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，采用北京Tiangen瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

1.3.8 gad序列比對

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化與T載體連接轉化藍白斑篩選后[14]送交上海生工生物工程服務有限公司測序，測序后校正圖譜峰值并將測序結果與L. brevis strain BH2的gad序列進行比對，分析同源性。

2 結果與分析

2.1 GABA標準曲線

用原子吸收分光光度計測0～10.5g/L不同質量濃度的GABA標準溶液，制得標準曲線，得回歸方程Y=0.0468x+0.0094(R2=0.997)。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對GABA產(chǎn)量的影響

以液體培養(yǎng)基為基礎，分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、丁二酸鈉為唯一碳源，制成不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種L. brevis BS2菌株，30℃靜置培養(yǎng)3d，檢測發(fā)酵液中GABA的含量，結果如圖1所示。

圖1 不同碳源對L. brevis BS2的GABA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source type on the production of GABA by L. brevis BS2 fermentation

由圖1可見，菌體對上述有機碳源利用率都較平穩(wěn)，其中以葡萄糖為碳源的菌株GABA產(chǎn)量最高，而對無機碳源丁二酸鈉利用率較低，故采用葡萄糖為主要碳源。

2.2.2 不同氮源對GABA產(chǎn)量的影響

圖2 不同氮源對L. brevis BS2的GABA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type on the production of GABA by L. brevis BS2 fermentation

以液體培養(yǎng)基為基礎，葡萄糖作為主要碳源，分別采用不同的有機氮和無機氮作為唯一氮源進行實驗，結果如圖2所示。菌株對胰蛋白胨和蛋白胨利用率比較高，但GABA產(chǎn)量低，牛肉膏和大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌株GABA產(chǎn)量高，故采用牛肉膏和大豆蛋白胨為復合氮源。

2.2.3 不同碳、氮源比例對GABA產(chǎn)量的影響

圖3 不同碳氮比對L. brevis BS2的GABA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon/nitrogen ratio on the production of GABA by L. brevis BS2 fermentation

以液體培養(yǎng)基為基礎，葡萄糖為碳源，牛肉膏和大豆蛋白胨為復合氮源，選擇不同的配比，觀察對菌體生長以及GABA產(chǎn)量的影響，從圖3可見，碳氮比為1:1時GABA產(chǎn)量最高，故為最佳比例。

2.2.4 不同底物質量分數(shù)對GABA產(chǎn)量的影響

圖4 不同底物質量分數(shù)對L. brevis BS2的GABA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the production of GABA by L. brevis BS2 fermentation

由圖4可見，底物質量分數(shù)為1%谷氨酸鈉時，GABA產(chǎn)量最高。

2.2.5 初始pH值對GABA產(chǎn)量的影響

以液體培養(yǎng)基為基礎，葡萄糖為碳源，牛肉膏和大豆蛋白胨為復合氮源，分別調pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，靜置培養(yǎng)3d后，測發(fā)酵液中GABA的含量。如圖5所示，當pH5.0時菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA量最高，達到6.32g/L，說明L. brevis BS2適合在微酸性環(huán)境中發(fā)酵產(chǎn)GABA。

圖5 初始pH值對L. brevis BS2的GABA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on the production of GABA by L. brevis BS2 fermentation

2. 3基因組提取結果檢測

瓊脂糖凝膠電泳檢測提取基因組，其結果如圖6所示，采用CTAB法提取的基因組效果很好，具有明顯的Smear拖尾條帶，說明基因組比較完整，有利于16S rRNA序列分析及目的基因的擴增。

圖6 L. brevis BS2基因組電泳檢測圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of L. brevis BS2 genomic DNA

2.4 S16 rRNA同源性分析

取得L. brevis BS2 16S rRNA 序列后，從GenBank基因數(shù)據(jù)庫中調取L. brevis strain BH2的16S rRNA 序列(DQ974207)進行同源性比較，結果顯示L. brevis BS2的16S rRNA 序列片段(1106bp)與L. brevis strain BH2的同源性較高，達到97%，可初步確定L. brevis BS2與L. brevis strain BH2的進化關系接近。

2.5 降落PCR擴增產(chǎn)物檢測

采用優(yōu)化的PCR反應條件，以L. brevis BS2基因組為模板，gadup與gadlow為上下游引物，采用降落PCR擴增得到與預期大小相同的1407bp片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳結果如圖7所示。圖中2～4號泳道是采用55～50℃退火溫度的降落PCR程序擴增得到的產(chǎn)物，電泳效果圖顯示有明顯的非特異性條帶，圖中1泳道為退火溫度提高到60～55℃的降落PCR擴增得到的產(chǎn)物，可見非特異性條帶已經(jīng)消失，所得目的條帶清晰明亮，特異性較高。

圖7 PCR擴增gad結果Fig.7 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of L. brevis BS2 gad gene

2.6 gad序列比對

圖8 gad基因序列同源性比較Fig.8 Nucleotide sequence comparison between L. brevis BS2 and BH2

圖9 gad基因序列比對結果Fig.9 Results of gad gene sequence alignment

以GenBank基因數(shù)據(jù)庫中L. brevis strain BH2的gad序列(EU084998.1)作為對照進行同源性比較，結果顯示L. brevis BS2菌株的gad序列1407bp和引物序列共1433bp與L. brevis strain BH2的gad具有高度同源性，同源性達到98%(圖8、9)，由此可確定所得目的基因是短小乳桿菌的谷氨酸脫羧酶基因。

3 討 論

本研究選取前期分離鑒定的高產(chǎn)GABA的富鋅短小乳酸桿菌L. brevis BS2作為研究對象。碳源是合成菌體的GABA碳架和能量的重要來源，而氮源是構成菌體核酸和蛋白質的重要來源，并且乳酸菌的谷氨酸脫羧酶脫羧反應消耗胞內H+，將谷氨酸轉變成堿性更強的GABA，同時消耗胞外H+，產(chǎn)生質子推動力和ATP，菌株適應的胞外pH值范圍為4.0～5.5[15]。為了檢測和提高GABA產(chǎn)量首先采用紙層析預染分析法進行培養(yǎng)基優(yōu)化，結果表明L. brevis BS2最佳產(chǎn)GABA的培養(yǎng)基為：初始pH 5.0，以葡萄糖為主要碳源，以大豆蛋白胨和牛肉膏為復合氮源，碳氮比為1:1，底物谷氨酸鈉質量分數(shù)為1%，發(fā)酵產(chǎn)GABA可達到6.32g/L，與優(yōu)化前GABA產(chǎn)量(4.8g/L)[10]相比提高了31.7%，表明該菌株有一定的應用前景，同時有必要進一步研究其生理生化特性、酶學性質、以及采取菌株誘變和進一步優(yōu)化發(fā)酵條件等方法以提高GABA產(chǎn)量。

同時，為分析和克隆L. brevis strain BH2谷氨酸脫羧酶基因以及工程菌株的構建做好前期工作，本研究對gad進行了初步的擴增和克隆分析。由于L. brevis BS2 gad的序列未知，故搜集了大量相關菌種的gad序列，尋找gad的保守序列以供參考，在此基礎上確定L. brevis strain BH2的gad序列為最佳參考序列，所設計的引物包括了全長的gad。在以菌株基因組為模板，應用常規(guī)PCR未發(fā)現(xiàn)擴增片段之后，采用降落PCR尋找最佳的退火溫度，提高產(chǎn)物特異性，減少非特異性條帶，同時提高保真性，減少錯誤摻入。應用降落PCR擴增出L. brevis BS2 的gad序列(1407bp)與L. brevis strain BH2的gad比對發(fā)現(xiàn)具有高度的同源性，同源性達到98%，由于測序誤差和擴增時可能的錯誤摻入，所得結果存在一定的誤差，后期研究應注意盡量減少誤差，如優(yōu)化測序方法或使用高保真Taq酶以避免dNTP摻入錯誤。

乳酸菌作為目前發(fā)酵食品生產(chǎn)中普遍使用的菌種，其眾多的保健功能、良好的風味和可靠的安全性已被廣大消費者認可。利用高產(chǎn)GABA并具富鋅能力的乳酸菌可開發(fā)高產(chǎn)GABA及富鋅的活性乳酸菌功能食品，達到集微量元素、乳酸菌益生功能于一體，使其在實踐生產(chǎn)與應用中具有廣闊的前景。

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Medium Optimization for Producing Gamma-aminobutyric Acid by the Fermentation of Lactobacillus brevis BS2 with Zinc-enriching ability and Cloning and Sequencing of Its Glutamate Decarboxylase Gene

XIE Xiao-yang，CHEN Yao，LIU Zhi-wen，GUO Xiao-yan，CHENG Xin，GAO Xiao-yu，XU Bo*
(Nanchang Key Laboratory of Fermentation Application Technology, College of Biology Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

The objectives of this work were to optimize the medium composition for improved production ofγ-aminobutyric acid (GABA) by the fermentation of Lactobacillus brevis BS2 with Zinc-enriching ability and to clone and sequence the glutamate decarboxylase (GAD) gene of this strain. GABA quantification was performed using pre-staining paper chromatography method. The optimal medium composition was determined as follows: carbon source, glucose; nitrogen source, soybean peptone plus beef extract; carbon/nitrogen ratio, 1:1; and substrate concentration, 1%, and the maximum GABA production reached up to 6.32 g/L under such conditions. CTAB method was used for the extraction of genomic DNA from stain BS2, and the extracted genomic DNA was used as the template for the amplification of a 1407 bp gad gene by touch down PCR. The gad gene was finally cloned into the T vector. The sequencing analysis showed that the gene had 98% homology with that of Lactobacillus brevis BH2, suggesting that the obtained target gene is the gad gene of Lactobacillus brevis.

Gamma-aminobutyric acid；Lactobacillus brevis BS2；glutamate decarboxylase；medium optimization；sequence analysis

Q936

A

1002-6630(2010)19-0304-05

2010-06-22

國家自然科學基金項目(31060208)；江西省科技廳科技支撐項目(2009BNB05704)；江西農業(yè)大學博士科研啟動基金項目(2001)

謝曉陽(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為微生物學。E-mail：denzil374@yahoo.com.cn

*通信作者：徐波(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：xubo583@sina.com