木香倍半萜對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的抑制作用

郝立杰,趙 烽,高治廷,許 卉,劉 珂

1煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,煙臺(tái) 264005;2煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司,煙臺(tái) 264006

木香倍半萜對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的抑制作用

郝立杰1,2,趙 烽1＊,高治廷1,許 卉1,劉 珂1

1煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,煙臺(tái) 264005;2煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司,煙臺(tái) 264006

對(duì) EL ISA法測(cè)定人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human VEGF)的檢測(cè)條件進(jìn)行研究,考察了酶標(biāo)板種類(lèi)、一抗包被時(shí)間、紫外輻照等對(duì)酶聯(lián)免疫反應(yīng)的影響,優(yōu)化了檢測(cè)條件:可采用廣州潔特公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板替代進(jìn)口 Costar酶標(biāo)板,一抗包被時(shí)間 24 h,一抗包被前紫外輻照 30 min可明顯提高酶標(biāo)板對(duì)包被抗體的親和力。利用優(yōu)化的檢測(cè)條件測(cè)定了木香揮發(fā)油、土木香揮發(fā)油、木香主要單體成分脫氫木香內(nèi)酯 (dehydrocostus lactone, 1)和木香烯內(nèi)酯(costunolide,2)對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞分泌VEGF的抑制作用,同時(shí)以MTT法測(cè)定藥物對(duì)A549腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果表明,木香揮發(fā)油、土木香揮發(fā)油、脫氫木香內(nèi)酯和木香烯內(nèi)酯在不影響細(xì)胞增殖的濃度范圍內(nèi),可明顯抑制A549細(xì)胞分泌VEGF。

VEGF;木香;土木香;脫氫木香內(nèi)酯;木香烯內(nèi)酯

血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要作用[1]。新生血管的生長(zhǎng)和成熟是一個(gè)復(fù)雜的多因子和多信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的結(jié)果,其中涉及到很多血管生成因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素 (angiopoietin)等,以及抑制血管生成的因子如內(nèi)皮細(xì)胞抑制素 (endostatin)、腫瘤抑素 (tumstatin)、可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 (s VEGFR)等。一般情況下這兩類(lèi)因子處于平衡狀態(tài)。腫瘤發(fā)生時(shí)能促進(jìn)血管生成因子分泌,其中最主要的是 VEGF。大量研究結(jié)果表明VEGF在許多癌癥組織中過(guò)量表達(dá),包括肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等。VEGF及其受體 (vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用,所以可以通過(guò)阻斷或干擾VEGF/VEGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)控制腫瘤生長(zhǎng)。近年來(lái)以VEGF及其受體作為靶分子的抗腫瘤新藥研發(fā)取得了很大的進(jìn)展,已經(jīng)有數(shù)個(gè)藥物經(jīng)美國(guó) FDA批準(zhǔn)上市。本文以 VEGF的酶聯(lián)免疫(EL ISA)檢測(cè)條件優(yōu)化為基礎(chǔ),研究木香揮發(fā)油及主要倍半萜單體化合物的抗腫瘤作用是否與抑制VEGF有關(guān)。

木香為菊科多年生草本植物木香Saussurea lappaDecne.的干燥根,別名:云木香、廣木香。原產(chǎn)印度,主要分布于我國(guó)陜西、甘肅、湖北、湖南、四川、云南、西藏等地,以四川、云南西北部種植較多,產(chǎn)量較大。商品木香目前主要分為三類(lèi),即木香、川木香及土木香,其中土木香主要作為木香的代用品使用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,木香具有行氣止痛之功效,多用于胃腸氣滯所致的脘腹脹痛、嘔逆少食或用于濕熱痢疾而腹痛,里急后重?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:木香還具有改善胃潰瘍[2,3]、收縮、炎癥[4,5]、肌梗塞及心絞痛[6]等作用,臨床上常用于潰瘍病、膽絞痛、支氣管哮喘等疾病的治療[7]。木香所含的主要有效成分存在于揮發(fā)油中,是以脫氫木香內(nèi)酯 (dehydrocostus lactone,1)和木香烯內(nèi)酯 (costunolide,2)為主的多種倍半萜類(lèi)化合物的混合物。Lee等[8]首次對(duì)木香烯內(nèi)酯的抗腫瘤作用進(jìn)行了探討,證明木香烯內(nèi)酯可通過(guò)釋放細(xì)胞色素 C誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。作者前期對(duì)木香和土木香進(jìn)行了化學(xué)成分研究,通過(guò)提取分離結(jié)合化學(xué)修飾等手段共獲得 18種木香倍半萜單體化合物并研究了其體外抗腫瘤活性,結(jié)果表明木香揮發(fā)油、土木香揮發(fā)油、脫氫木香內(nèi)酯、木香烯內(nèi)酯對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖均表現(xiàn)較好的抑制活性[9],本文擬在對(duì) VEGF酶聯(lián)免疫檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,研究以上活性部位及活性單體的抗腫瘤活性是否與VEGF相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國(guó) Costar及廣州潔特 (JET)生物過(guò)濾制品有限公司生產(chǎn)的 96孔可拆分高親和力聚苯乙烯酶標(biāo)板;CKX31型倒置顯微鏡 (菲律賓奧林巴斯公司);恒溫 CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó) Thermo公司);5810 R型臺(tái)式高速低溫離心機(jī) (德國(guó) Eppendorf公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國(guó)Biotek集團(tuán))。

木香揮發(fā)油、土木香揮發(fā)油、脫氫木香內(nèi)酯和木香烯內(nèi)酯(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 1)以細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)DMSO溶解,并稀釋至所需濃度,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。人血管?nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體 (MAB293)、生物素化抗體 (BAF293)、重組人 VEGF 165(293-ve)、Streptavidin-HRP (DY998)、 Substrate Reagent (DY999)購(gòu)自 R&D公司;RP M I 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自 Invitrogen公司;胰酶、MTT、DMSO購(gòu)自Amresco公司,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

圖 1 脫氫木香內(nèi)酯和木香烯內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of dehydrocostus lactone and costunolide

1.2 緩沖液配制

包被液:PBS(磷酸鹽緩沖液);封閉液:1% BSA,5%蔗糖,0.05%疊氮鈉/PBS;洗滌液:0.05% Tween-20/PBS;酶結(jié)合物稀釋液:1%BSA/PBS;顯色劑:R&D公司 Substrate Reagent(DY999);終止液:1 mol/L硫酸

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞A549為煙臺(tái)大學(xué)分子藥理實(shí)驗(yàn)室保種。用含 10%胎牛血清的 RPM I 1640培養(yǎng)液(含青霉素 1×105U/L,鏈霉素 100 mg/L),于 37℃CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),隔天傳代。A549細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞活性

將細(xì)胞密度為 1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),每孔 200μL,于 CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。24 h后分別加入不同濃度的待測(cè)試樣品,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔,同時(shí)設(shè)DMSO空白孔,培養(yǎng) 48 h后,每孔加入MTT 8μL(終濃度為 200 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后棄去上清,吸干殘留液,每孔加入DMSO 100μL,振搖至生成的藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后,以 630 nm為參比波長(zhǎng),用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光值 (A570)。細(xì)胞增殖抑制率 (%) =100×(1-實(shí)驗(yàn)組 A570/空白對(duì)照組 A570)。

1.5 測(cè)定蛋白濃度

以不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)溶液繪制工作曲線,利用 Bradford法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液總蛋白濃度。

1.6 EL ISA檢測(cè)條件的優(yōu)化研究

1.6.1 聚苯乙烯酶標(biāo)板的選擇

分別采用 Costar及 JET的 96孔可拆分高親和力聚苯乙烯酶標(biāo)板作為固相載體,進(jìn)行 EL ISA檢測(cè)并比較結(jié)果。

1.6.2 聚苯乙烯酶標(biāo)板經(jīng)紫外線輻照處理

聚苯乙烯酶標(biāo)板置于裝有紫外燈 (S W-CJ-1Cu型,蘇州凈化設(shè)備有限公司)的醫(yī)用凈化工作臺(tái)上,固定紫外燈與酶標(biāo)板基底的垂直距離為 10 cm,于空氣中對(duì)酶標(biāo)板作 30 min輻照處理,完畢后置室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 抗體包被時(shí)間的改變

用 PBS磷酸鹽緩沖液將 hVEGF單克隆抗體稀釋至 1μg/mL后,將其置于 4℃中分別包被 24、48、72 h,封閉洗滌甩干后備用。

1.6.4 EL ISA檢測(cè)方法

經(jīng)包被、封閉、加樣、溫育等過(guò)程,拍干后加生物素化抗 hVEGF抗體 100μL/孔,37℃溫育 60 min,洗板 4次,拍干后加入HRP酶結(jié)合物 100μL/孔,37℃溫育 30 min,洗板 4次,徹底拍干后加入 T MB顯色劑 100μL/孔,37℃溫育 30 min,然后加入終止液50μL終止反應(yīng),酶標(biāo)儀 450 nm處測(cè)量吸光值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EL ISA檢測(cè)條件的優(yōu)化研究

2.1.1 聚苯乙烯酶標(biāo)板的選擇

分別取 Costar及 JET公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板條,加入抗 hVEGF單克隆抗體在 4℃下包被 24 h,進(jìn)行EL ISA測(cè)定。如圖 2所示,Costar及 JET酶標(biāo)板條對(duì)抗 hVEGF單克隆抗體的親和力無(wú)明顯差別,由于JET酶標(biāo)板價(jià)格低于 Costar酶標(biāo)板,因此以后的實(shí)驗(yàn)中均選擇 JET酶標(biāo)板以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

圖 2 不同廠家酶標(biāo)板的比較Fig.2 Comparison of EL ISA plates from differentmakers

2.1.2 紫外輻照的影響

如圖 3所示,經(jīng)紫外輻照后 JET酶標(biāo)板所測(cè)得吸光值較輻照前明顯提高,表示紫外輻照可提高JET酶標(biāo)板條對(duì)抗 hVEGF單克隆抗體的親和力。

圖 3 紫外輻射對(duì) JET酶標(biāo)板吸光值的影響Fig.3 Effect ofUV on the absorbency of JET plate

2.1.3 包被時(shí)間的影響

如圖 4所示,一抗包被 24 h即可達(dá)到較理想的效果,延長(zhǎng)包被時(shí)間至 48 h或 72 h吸光值反而有所降低,因此將一抗包被時(shí)間確定為 24 h。

圖 4 不同包被時(shí)間對(duì)吸光值的影響Fig.4 Effect of coating time on the absorbency

2.2 木香揮發(fā)油、土木香揮發(fā)油及倍半萜單體對(duì)VEGF的抑制作用

2.2.1 對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

按照 1.4節(jié)所述MTT方法檢測(cè)藥物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。如表 1所示,木香揮發(fā)油在 0.20～3.12μg/mL,土木香揮發(fā)油在0.20～12.5μg/mL,脫氫木香內(nèi)酯和木香烯內(nèi)酯在0.20～25μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用。

表 1 藥物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of test drugs on the cell proliferation ofA549

3.12 2.2 10.1 6.5 -7.5 1.56 0.1 -7.2 4.6 -3.6 0.78 2.9 0.2 2.2 0.3 0.39 0.3 1.3 0.3 2.5 0.20 4.3 0.6 1.5 6.1

2.2.2 對(duì)A549細(xì)胞分泌VEGF的抑制作用

在藥物對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用的濃度范圍內(nèi),以優(yōu)化后的 EL ISA檢測(cè)條件測(cè)定 VEGF濃度。取 JET酶標(biāo)板進(jìn)行紫外輻照 30 min后,每孔加入100μL抗人VEGF單克隆抗體,將其置于 4℃中包被 24 h后,封閉洗滌甩干后,加入樣本按照 1.6.4所述方法進(jìn)行測(cè)定,吸光度值和VEGF濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 5所示,根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本中VEGF的濃度。

另外以不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)溶液繪制工作曲線 (圖 6),利用 Bradford法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本中的總蛋白濃度。

圖 5 VEGF濃度和吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Working line of the VEGF concentration and absorbance

圖 6 BSA蛋白濃度和吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Working line of the BS A concentration and absorbance

最后,按照以下公式計(jì)算樣本單位蛋白中所含的VEGF濃度:單位蛋白中所含的VEGF濃度 (pg/ mg)=VEGF濃度(pg/mL)/總蛋白濃度(mg/mL),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2,組間比較采用 t檢驗(yàn)。

表 2 藥物對(duì)A549細(xì)胞分泌VEGF的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of test drugs on the release ofVEGF in A549 cells

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF濃度的同時(shí),利用Bradford法測(cè)定總蛋白含量,計(jì)算單位蛋白中VEGF的含量,可校正由于細(xì)胞分布不均或細(xì)胞死亡導(dǎo)致的測(cè)定誤差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,木香揮發(fā)油和土木香揮發(fā)油均可明顯抑制 A549細(xì)胞分泌VEGF,作用強(qiáng)度相當(dāng),可為使用土木香作為木香的臨床替代品提供一定的理論依據(jù)。脫氫木香內(nèi)酯和木香烯內(nèi)酯為木香和土木香藥材中的主要化學(xué)成分,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種倍半萜類(lèi)化合物可明顯抑制A549細(xì)胞分泌VEGF,提示VEGF可能為木香及其制劑發(fā)揮抗腫瘤作用的主要作用靶點(diǎn)之一,木香及其有效成分對(duì)于VEGF蛋白表達(dá)及基因水平的影響正在進(jìn)一步研究中。

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Inhibitory Effects of Sesquiterpenes fromSaussurea lappa on the Vascular Endothelial Growth Factor

HAO Li-jie1,2,ZHAO Feng1＊,GAO Zhi-ting1,XU Hui1,L IU Ke1

1School of Phar m acy,YantaiUniversity,Yantai 264005,China;2Yantai Science&B iotechnology Co.,Ltd.,Yantai 264006,China

In this paper,the EL ISA method to detect human VEGF was studied and optimized.The effectof EL ISA plate materials,coating time of the capture antibody,ultraviolet irradiation were studied,and the optimized detection condition is following:Jet EL ISA plate can be used instead of costar EL ISA plate;24 h is the best for the capture antibody coating time;ultraviolet irradiation increases the reaction to the capture antibody.Petroleum ether fractions ofSaussurea lappaandInula helenium,two main constituents dehydrocostus lactone(1)and costunolide(2)were evaluated for their inhibitory activities on the VEGF realease in human lung cancer cell line A549.The effects of above test samples on the cell proliferation ofA549 were evaluated byMTTmethod.The results indicated that the petroleum ether fractions of S. lappa andI.helenium,dehydrocostus lactone and costunolide significantly inhibited theVEGF release,wherereas the cell proliferation ofA549 cellswas not affected.

VEGF;Saussurea lappa;Inula helenium;dehydrocostus lactone;costunolide

R969.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0687-05

2009-05-27 接受日期:2009-09-22

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金 (2006BS02005, 2007BS02005)

＊通訊作者 Tel:86-535-6706921;E-mail:zhaofeng74@yahoo.com.cn