皮膚組織中SOD活性測定的樣品制備方法

潘衛(wèi)松 ，肖 瑛 ，李 薇

（1.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州 510610；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510632；3.暨南大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省高校重點實驗室,廣東廣州 510632）

超氧化物歧化酶（SOD）是生物機體內(nèi)重要的自由基清除酶，其活性的高低表征著機體的抗氧化能力和衰老程度。目前實驗室里比較普遍的SOD測定方法是黃嘌呤氧化酶法[1]。病理改變的過程中，機體功能改變一般是先于結(jié)構(gòu)變化的，因此評價化妝品和藥物是否確實能夠延緩皮膚組織的衰老，皮膚組織中的SOD活性是一個有意義的評價指標(biāo)。由于皮膚組織中SOD活性測定方法的報道較少，目前市面上SOD試劑盒也無法直接測出大鼠皮膚組織中SOD酶的活性，因此本研究以南京建成生物工程公司的SOD試劑盒為基礎(chǔ)，建立了測定皮膚組織中SOD活性的方法，為評價化妝品、保健品和中藥的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠 6只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心蘇小茹老師提供；動物合格證號：粵監(jiān)證字2005A008。

1.2 儀器和試劑

電動玻璃勻漿器（江蘇金壇市佳美儀器廠）；SCJ10005低溫高速離心機；紫外分光光度計 （CARY 100）；恒溫水?。℅RANT SUB14）；MSI旋渦混合器 （廣州 IKA 公司）；SOD 試劑盒（南京建成生物工程公司，批號：20070126）；牛血清白蛋白（Biotech 級，AMRESCO 公司，批號：303903A）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

大鼠取皮膚組織約0.5 g，加預(yù)冷的生理鹽水，置電動玻璃勻漿器中，在冰浴中勻漿8 min，制成10%的皮膚勻漿液。將勻漿液平分成兩份，分別以3 000 r/min，0℃離心10 min和15 min，所得上清液即為粗酶液。然后分別取粗酶液加入底物溶液，以旋渦混合器振蕩0.5min，使之混合均勻后置37℃恒溫水浴40min后，取出加入顯色劑，在旋渦混合器上混勻，室溫放置10 min后，在550 nm處測定吸光度。同法平行制備空白管，作為空白對照。以對照管吸光度減去反應(yīng)管吸光度的差值比上對照管吸光度值的結(jié)果計算SOD的活性。粗酶液以考馬斯亮藍(lán)法[2]測定其中蛋白含量，以牛血清白蛋白溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 結(jié)果

不同測定條件下SOD酶的百分抑制率見表1。6個不同條件下的SOD酶的百分抑制率均為15%～55%。蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝1.783 4X－0.136 6（r＝0.991 5），線性范圍為 0.2～1.6 mg/ml。各個條件下的粗酶液的蛋白含量見表2。由表1、2可知，在轉(zhuǎn)速為3 000 r/min時，離心時間的長短對粗酶液中蛋白含量沒有明顯的影響。

表1 不同測定條件下SOD酶的百分抑制率（±s，%）

表1 不同測定條件下SOD酶的百分抑制率（±s，%）

離心時間（min） 取樣量（μl）60 80 100 10 15 40.66±5.89 34.32±7.37 42.00±7.03 37.85±3.63 46.55±3.53 43.00±4.74

表2 不同測定條件下SOD粗酶液的蛋白含量（±s，mg/ml）

表2 不同測定條件下SOD粗酶液的蛋白含量（±s，mg/ml）

離心時間 10 min 15 min 1.002 8±0.325 7 1.042 9±0.367 0蛋白含量

3 討論

藥品評價正日益受到重視，針對藥品，保健品和化妝品的安全性和有效性、功能性評價得到了廣泛開展[3-6]。目前國內(nèi)藥品、保健品和化妝品對抗皮膚衰老功效評價的實驗研究尚少見報道。筆者在進(jìn)行有關(guān)中藥抗皮膚衰老的評價時，選擇測定皮膚組織中SOD酶的活性來評價此類中藥的功效。經(jīng)過比較市面上現(xiàn)有的SOD試劑盒后，筆者選擇了南京建成生物工程公司生產(chǎn)的SOD試劑盒來測定大鼠皮膚組織中的SOD活性。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，如果完全按照試劑盒說明書的要求，取30～50 μl所制備的1%皮膚組織勻漿液將無法測出SOD活性。因此本研究通過改進(jìn)樣品處理方法以建立測定皮膚組織中SOD活性的方法。

經(jīng)過預(yù)實驗，筆者選擇制備10%的皮膚組織勻漿，經(jīng)過0℃，3 000 r/min，10 min或15 min的離心制備SOD的粗酶液，然后分別取60、80和100 μl的樣品測定皮膚組織中SOD酶的活性，從中選取最佳的測定條件。結(jié)果表明所測定的SOD酶百分抑制率均在15%～55%范圍內(nèi)。由于酶活測定的最佳取樣量為百分抑制率在48%～50%，故在上述結(jié)果中，SOD酶活測定的最佳條件是在0℃，3 000 r/min條件下離心10 min之后，取上清液100 μl進(jìn)行測定。

在測定全血和肝、腦組織中SOD酶活的過程中，筆者使用雙縮脲法測定樣品中的蛋白含量，但皮膚組織的勻漿液在離心后，其蛋白含量低于雙縮脲法的線性范圍，于是筆者采用考馬斯亮藍(lán)法來測定皮膚組織中SOD酶的粗酶液的蛋白含量。 結(jié)果表明，該法回歸曲線的線性范圍為 0.2～1.6 mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.991 5，能夠滿足測定SOD酶粗酶液中蛋白含量的要求。

通過本實驗，筆者建立了利用南京建成生物工程公司SOD試劑盒來測定皮膚組織中SOD活性的方法，為評價中藥和化妝品對皮膚組織的抗氧化和抗衰老功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]李忠琴,許小平,楊海麟,等.辣根過氧化物酶分光光度法測定黃嘌呤氧化酶的活性[J].分析化學(xué),2006,34(6)∶821-824.

[2]John A,Smith.精編分子生物學(xué)實驗指南[M].北京∶科學(xué)出版社,332-333.

[3]肖斌,張新蘭.從藥品評價平臺建設(shè)看我國科技評價的發(fā)展趨勢[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2010,7(5)∶5-6.

[4]潘衛(wèi)松,肖瑛.透明質(zhì)酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,6(20)∶45-47.

[5]房林,趙振民.皮膚衰老機制的研究進(jìn)展[J].北京∶人民軍醫(yī),2010,53(2)∶149-152.

[6]潘衛(wèi)松,肖瑛,潘建明.熒光素鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國藥房,2009,20(13)∶1010-1012.