三種肌松藥對人離體靜脈血中性粒細胞CD11b表達的影響

劉尊遠，張 巖，薛 峰

（1.濰坊醫(yī)學院麻醉系，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院麻醉科，山東濰坊 261041；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院檢驗科，山東濰坊 261041）

圍術期機體在創(chuàng)傷刺激下可引起免疫功能的變化，中性粒細胞（PMN）是機體免疫反應的第一道防線，CD11b在PMN表面的大量表達在炎癥反應中起著重要的調節(jié)作用，目前有關麻醉藥對CD11b表達的研究文獻較多，但關于肌松藥的免疫學方面研究報道甚少，本文通過采用流式細胞儀分析三種中長效肌松藥對成人離體靜脈血中性粒細胞CD11b表達的影響，進而為肌松藥的免疫學研究和合理應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

順苯磺酸阿曲庫銨（批號：10030713，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國），哌庫溴銨（批號：A78048A，匈牙利吉利大藥廠，匈牙利），維庫溴銨（批號：100302.1，浙江仙琚制藥股份有限公司）脂多糖（LPS，批號：029k4023，Sigma 公司，美國），F(xiàn)ITC標記MouseAnti-HumanCD11b抗體（批號：4AH110912F，北京四正柏生物科技有限公司），電熱恒溫水溫箱（上海醫(yī)用恒溫設備廠），F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀（Becton Dicknson公司，美國），可調定量加液器（上海求精玻璃儀器廠），XW-80A渦旋混合器（上海精科實業(yè)有限公司），LD5-2A型低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），一次性使用負壓采血器（山東永康公司）。

1.2 受試對象

年齡 20～40 歲，體重 55～75 kg，ASA Ⅰ級、無吸煙史、無感染及免疫系統(tǒng)疾病、近期（1周內）未服用影響免疫功能的藥物，男性和女性各5例。

1.3 實驗分組

采用隨機區(qū)組設計，實驗分為14組，空白組[K]；靜息無刺激下藥物各組[J]{順阿曲庫銨1，2濃度組；哌庫溴銨1，2濃度組；維庫溴銨 1，2 濃度組}；脂多糖（LPS）組[L]；刺激下藥物各組[C]｛三種1，2濃度肌松藥分別添加脂多糖組｝。

1.4 實驗步驟與檢測

取上述抗凝全血，每份血樣均同時分配于上述各處理組，各組每例加入100 μl全血；而后，空白組[K]及LPS組[L]添加生理鹽水100 μl對照，其余各組分別加入相應濃度藥物100 μl達到對應終濃度；把上述各組樣品放入37℃恒溫箱避光孵育1.5 h。[L]和[C]下各組加入終濃度為1 μg/ml的脂多糖 100 μl，[K]和[J]下各組添加生理鹽水 100 μl對照；各樣品繼續(xù)入37℃恒溫箱避光孵育2 h；隨后，取上述樣品加入10 μl FITC標記CD11b抗體，室溫避光孵育20 min，加入2 ml紅細胞裂解液（BD公司，美國）混勻后避光放置10 min，樣品離心5 min棄上清，沉淀用PBS洗2次，0.5 ml PBS重懸細胞后，流式細胞儀上機檢測[1-2]。用PMN上CD11b平均熒光強度來表示CD11b的表達水平，用CELLQuest軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行秩和檢驗，F(xiàn)riedman檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

統(tǒng)計學分析顯示，靜息組（前7組）與激活組（后7組）均數(shù)比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），靜息組與激活組二者分別進行組內比較均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；多個樣本均數(shù)間的兩兩比較顯示：哌庫溴銨低濃度組和空白組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），哌庫溴銨高濃度組與維庫溴銨低濃度組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），哌庫溴銨高濃度組與低濃度租比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。維庫溴銨低濃度組與空白組比較有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），維庫溴銨低濃度組與順阿曲庫銨低濃度組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余各組比較均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

分析表明,與空白組比較，低濃度維庫溴銨和低濃度哌庫溴銨均可下調靜息狀態(tài)CD11b的表達。哌庫溴銨高低濃度間表達有差別，但與空白組比較均無明顯差異。順阿曲庫銨低濃度組與維庫溴銨低濃度組有差別，但順阿曲庫銨兩濃度組與空白組比較均無明顯差異。三種肌松藥對LPS激活狀態(tài)下的PMN表面CD11b表達均無明顯差異。

表1 各組樣本對表達的影響（n=10，±s）Tab.1 Effects of each group on the CD11b expression(n=10,±s)

表1 各組樣本對表達的影響（n=10，±s）Tab.1 Effects of each group on the CD11b expression(n=10,±s)

與空白組比較,*P＜0.05；與哌庫溴銨低濃度比較，▲P＜0.05；與維庫溴銨低濃度比較，●P＜0.05Compared with blank group,*P＜0.05;compared with low concentration of pipecuronium group,▲P＜0.05;compared with low concentration of vecuronium group,●P＜0.05

組別 濃度（μg/ml） CD11b表達的平均光密度強度空白組順阿曲庫銨組哌庫溴銨組維庫溴銨組0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 LPS組順阿曲庫銨+LPS組哌庫溴銨+LPS組維庫溴銨+LPS組0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 297.304±15.623 272.132±32.787 300.571±14.320●324.523±24.675▲●262.841±26.722*331.811±92.084 268.429±5.208*810.672±62.232 778.598±51.218 778.925±54.058 765.107±55.833 801.510±50.283 791.032±48.601 813.651±32.233

3 討論

CD11b/CD18是白細胞整合素亞家族中的一員，CD11b／CD18是 α，β 異二聚體， 以非共價鍵連接，CD11a、b、c均共用CD18這條β鏈，而CD11b／CD18是中性粒細胞最主要的整合素局限在白細胞上表達，主要分布于PMN、單核-吞噬細胞和某些淋巴細胞表面，可參與補體結合和吞噬調理，并在PMN和單核細胞與內皮細胞的黏附過程中發(fā)揮重要作用，進而參與免疫炎癥反應[3]。有報道，CD11b表達上調還可抑制PMN凋亡[4]。本實驗研究證實CD11b主要表達于PMN表面，單核細胞及淋巴細胞表面僅有少量表達，進一步表明CD11b與中性粒細胞聯(lián)系密切。

本實驗采用文獻報道的微量全血流式細胞技術測定PMN表面 CD11b的表達，盡可能接近生理全血環(huán)境[1-2]，實驗設定的三種肌松藥物的兩濃度也基本接近麻醉誘導和維持濃度[5]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)低濃度哌庫溴銨和維庫溴銨在靜息狀態(tài)下可抑制CD11b表達，但對LPS激活狀態(tài)下的CD11b表達無影響，可能與實驗中LPS激活作用過強、時間過長有關。同時發(fā)現(xiàn)靜息無LPS刺激狀態(tài)下包括空白組在內各組整體均數(shù)普遍較文獻報道有所抬高，可能是實驗進程中采用振蕩器搖勻機械刺激所致，這與文獻報道機械刺激可加速CD11b表達一致[6]。本研究進一步表明：麻醉藥對CD11b表達的抑制與PMN所處的狀態(tài)、用藥劑量以及用藥時機有關[1-2]，但藥物與抑制效應間無劑量相關性，即增加藥量抑制效應不會相應增強[7]。本實驗研究的三種肌松藥是當今臨床應用最為普遍的三種中長效非去極化肌松藥，本次小樣本資料研究結果發(fā)現(xiàn)前兩種甾體類肌松藥可抑制靜息狀態(tài)的PMN表面CD11b的表達，這是否與肌松藥過敏反應有關，文獻多數(shù)報道維庫溴銨、哌庫溴銨、順阿曲庫銨組胺釋放作用很少[8-9]。也有報道高濃度的順阿曲庫銨皮內實驗可引起風團反應和輕中度肥大細胞脫顆粒反應[10]。近來研究發(fā)現(xiàn)肌松藥引起的過敏反應與 CD63、CCR3、CD11b 的表達呈現(xiàn)相關性[11-12]。CD63 不僅表達于嗜堿粒細胞，還表達于PMN表面并參與PMN活化和內皮黏附功能。肌松藥導致的過敏反應推測可能與圍術期創(chuàng)傷激活炎癥反應導致外周血中細胞因子釋放增加[13-14]，進而影響CD11b、CD63的表達和激活有關，但在肌松藥未導致過敏現(xiàn)象時CD11b和CD63的表達有何種相關尚不清楚，可能有多種中間機制調節(jié)其免疫穩(wěn)定性。另外，本研究哌庫溴銨和維庫溴銨均屬于甾體類肌松藥，順阿曲庫銨為卞異喹啉類，這是否與兩類藥物的分子結構基團和化學特性有關，尚待進一步研究論證。

綜上所述，接近臨床肌松維持濃度的維庫溴銨和哌庫溴銨可下調靜息狀態(tài)離體人靜脈血中性粒細胞表面CD11b表達，順阿曲庫銨對離體人靜脈血中性粒細胞表面CD11b表達無影響。三種肌松藥對LPS強刺激下的離體靜脈全血中的CD11b表達均無影響。

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