人工寒潮對高血壓大鼠腦內(nèi)ET、CGRP、TF和TM 的影響

翟俊格,李常新,吳曉巍,王慧芳,祁玉鳳,高潤蘭

眾所周知,腦卒中好發(fā)于秋末冬初。在寒冷季節(jié),尤其是氣溫驟降時,發(fā)病明顯增多[1],提示寒潮可能影響某些與發(fā)病相關(guān)的因子,使之發(fā)生變化而致病。因此尋找寒潮誘發(fā)腦卒中的發(fā)病因素,對其防治具有重要的臨床意義。本研究通過建立易卒中型腎血管性高血壓大鼠(stroke-prone renovascular hypertensive rats,RHRSP)模型并模擬自然界寒潮,觀察腦卒中發(fā)生情況,采用免疫組化方法檢測大鼠腦組織內(nèi)皮素(endothelin,ET)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、組織因子(tissue factor,TF)及血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin,TM)變化,探索寒潮誘發(fā)腦卒中可能的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與模型制備 選用健康的雄性封閉群Sprague Dawley(SD)大鼠 120只,鼠齡 60 d～ 90 d,體重 80 g～ 120 g,由山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。以顆粒型大鼠飼料喂養(yǎng),飲用自來水,動物房溫度控制在20℃左右,光暗周期24 h,為正常晝夜節(jié)律。80只大鼠用雙腎雙夾法復(fù)制RHRSP模型[2];40只采用開腹分離腎動脈、不夾閉的假手術(shù)方法,其余操作步驟同模型復(fù)制。

1.2 神經(jīng)行為學(xué)評分 按Longa 5分制法由2人同時對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分。規(guī)定Longa評分≥1分為腦卒中。

1.3 血壓測定與動物分組 用SDP-1型大鼠心率血壓計(jì)(中日友好醫(yī)院研制)測量大鼠尾動脈收縮壓,術(shù)前3 d連續(xù)測血壓作為基礎(chǔ)血壓,術(shù)后每 2周測血壓1次,觀察 12周。術(shù)后 2周血壓較術(shù)前增高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上為模型復(fù)制成功標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)從復(fù)制成功的RHRSP模型中取出36只作為高血壓組,在假手術(shù)方法大鼠中選36只作為假手術(shù)組。

在術(shù)后12周時,剔除飼養(yǎng)過程中Longa評分≥1分的4只大鼠(已發(fā)生腦卒中),從復(fù)制成功的76只 RHRSP模型中選取Longa評分為0、體重 270 g～330 g的RHRSP大鼠60只,隨機(jī)分為寒潮組和非寒潮組,每組均為30只。

1.4 人工模擬寒潮 按照氣象局規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),寒潮定義為日平均氣溫在24 h內(nèi)急劇降溫8℃或以上(48 h內(nèi)降溫10℃或以上),而且整個過程最低氣溫≤5℃。利用改裝的RXZ-300A型智能人工氣候箱(寧波江南儀器廠)模擬寒潮,在此過程中用WS508B溫濕度表(北京市亞光儀器有限責(zé)任公司)驗(yàn)證溫度及相對濕度,以判定控制溫濕度的偏差。人工氣候箱中,保持60%的相對濕度,寒潮溫度設(shè)置以22℃12 h,4℃12 h為1 d循環(huán),共3 d。不經(jīng)歷人工寒潮者,作為非寒潮組。

1.5 標(biāo)本的取材、制備及免疫組化檢測 分別在寒潮時3 h、6 h、12 h及寒潮后12 h、24 h的時段每組各取6只處死,并在處死前進(jìn)行Longa評分。將所取大鼠麻醉后,快速斷頭取腦,先觀察記錄出血灶發(fā)生情況,再經(jīng)1%TTC溶液染色后大體觀察梗死灶情況。制備石蠟切片,HE染色,光鏡檢查病理改變。

取相鄰切片采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法檢測各抗體的表達(dá),嚴(yán)格按試劑盒(大鼠SP免疫組化試劑盒及顯色試劑盒均系北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。圖像應(yīng)用Kontron IBAS全自動圖像分析系統(tǒng)(德國)進(jìn)行定量分析,測定觀察部位相對灰度的平均值,應(yīng)用免疫組織化學(xué)定量計(jì)算公式[3],得出陽性單位(PU)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用 t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血壓變化 高血壓組術(shù)后血壓升高,在各時間點(diǎn)血壓明顯高于術(shù)前(P＜0.05);假手術(shù)組術(shù)后血壓值略有波動,高血壓組血壓明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。詳見表1。

表1 兩組不同時段血壓變化(±s)mmHg

表1 兩組不同時段血壓變化(±s)mmHg

組別 術(shù)前 術(shù)后2周 術(shù)后4周 術(shù)后6周 術(shù)后8周 術(shù)后10周 術(shù)后12周高血壓組 120.71±12.67 137.81±14.301)2) 147.20±16.181)2) 155.72±18.141)2) 170.16±14.691)2) 179.21±19.471)2) 182.64±18.771)2)假手術(shù)組 122.30±11.28 124.42±14.43 125.30±13.39 124.61±12.78 125.71±14.76 123.81±13.35 125.60±15.12與假手術(shù)組比較,1)P＜0.05;與同組術(shù)前比較,2)P＜0.05

2.2 寒潮后卒中情況 寒潮組共6只發(fā)生卒中,非寒潮組共1只發(fā)生卒中,兩組卒中發(fā)病率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7只腦卒中大鼠共有11個病灶,其中寒潮組中1只有 2處梗死灶、3只各有2處出血灶,其余2只大鼠各有1處梗死灶;非寒潮組1只有1處梗死灶。共有梗死灶 5個(多為小病灶),出血灶6個(多為點(diǎn)狀出血灶),其中分布在皮質(zhì)或皮質(zhì)下白質(zhì)的病灶8個,基底節(jié)區(qū)2個,其他部位1個。寒潮組與非寒潮組的病灶數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 免疫組化法檢測ET和CGRP的表達(dá) 寒潮后12 h、24 h,與非寒潮組比較,CGRP含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在寒潮時段3 h、6 h、12 h,與非寒潮組比較,寒潮組 ET和 CGRP的含量明顯增高(P＜0.05)。詳見表2。

表2 兩組ET和CG RP在不同時間點(diǎn)的表達(dá)(±s)

表2 兩組ET和CG RP在不同時間點(diǎn)的表達(dá)(±s)

組別 ET CGRP寒潮組 寒潮3 h 19.44±4.621) 18.67±5.211)寒潮6 h 17.46±4.171) 17.85±4.051)寒潮12 h 16.96±3.251) 16.46±3.971)寒潮后12 h 15.54±3.22 15.67±4.20寒潮后24 h 15.24±3.14 14.82±3.80非寒潮組 寒潮3 h 13.47±3.83 19.48±4.86寒潮6 h 13.21±3.83 18.86±3.93寒潮12 h 12.68±3.83 18.50±3.59寒潮后12 h 12.18±2.90 17.70±3.76寒潮后24 h 12.10±2.79 17.54±3.53與非寒潮組同時間比較,1)P＜0.05

2.4 免疫組化法檢測TF和TM的表達(dá) 在寒潮時段3 h、6 h、12 h,與非寒潮組相比,寒潮組TF和TM 的含量明顯增高(P＜0.05)。詳見表4。

表3 兩組T F和T M在不同時間點(diǎn)的表達(dá)(±s)

表3 兩組T F和T M在不同時間點(diǎn)的表達(dá)(±s)

組別 TF TM寒潮組 寒潮3 h 24.64±5.221) 20.27±4.261)寒潮6 h 22.83±5.121) 19.22±3.711)寒潮12 h 21.07±4.451) 18.04±4.821)寒潮后12 h 20.91±4.75 17.65±3.66寒潮后24 h 19.38±4.32 16.05±3.04非寒潮組 寒潮3 h 16.24±4.23 14.02±3.81寒潮6 h 15.64±4.63 13.25±2.88寒潮12 h 14.71±4.01 13.03±2.35寒潮后12 h 14.23±3.72 12.87±3.10寒潮后24 h 14.07±3.44 12.06±2.79與非寒潮組同時間比較,1)P＜0.05

3 討 論

長期慢性高血壓可促進(jìn)動脈硬化、動脈粥樣斑塊或微動脈瘤形成,若血管內(nèi)皮細(xì)胞受刺激或受到損傷時,凝血因子被活化或含量增高,抗凝因子含量減少,常伴有血液黏度增高和血流減慢等血流動力學(xué)變化[4],在此基礎(chǔ)上氣溫的驟降或過大波動可能誘發(fā)缺血性腦卒中的發(fā)生[5]。本研究使用RHRSP,血壓穩(wěn)定升高,可很好模擬臨床高血壓的發(fā)病過程,用此模型進(jìn)行腦卒中及其相關(guān)研究結(jié)果可靠。利用改裝的人工氣候箱模擬自然界的寒潮,觀察寒潮對腦卒中發(fā)生的影響,并進(jìn)行相關(guān)因子的檢測,以求更深入探索其致病機(jī)制。

ET和CGRP可強(qiáng)烈調(diào)節(jié)血管舒縮,其作用相互拮抗,前者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中(下丘腦和紋狀體)含量最高,能使血管劇烈收縮,同時它也是內(nèi)源性的致?lián)p傷因子,其水平可反映腦組織的損傷程度[6]。CGRP分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)以及血管等組織[7],是體內(nèi)最強(qiáng)的舒血管多肽,能拮抗ET作用,使血管舒張,屬于內(nèi)源性保護(hù)因子,在病理?xiàng)l件下抑制ET大量釋放,還能對ET的生物效應(yīng)產(chǎn)生拮抗作用。本研究中,寒潮組ET和CGRP的含量在寒潮時段均發(fā)生變化,推測寒冷刺激機(jī)體可出現(xiàn)強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng),交感神經(jīng)興奮,釋放兒茶酚胺等神經(jīng)遞質(zhì),引起動脈收縮。在慢性高血壓引起血管病變的基礎(chǔ)上,可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊破裂或出血,損傷血管內(nèi)皮,誘發(fā)ET的表達(dá)和釋放,從而更加劇血管收縮;此時作為機(jī)體可能的一種代償調(diào)節(jié)[8],拮抗因子CGRP的含量也相應(yīng)升高,使血管舒張,以提高腦血流量,減輕缺血缺氧從而減輕腦組織損傷。

TF和TM也是作用相反的功能因子,在凝血、抗凝系統(tǒng)中起重要作用。TF是外源性凝血的啟動因子,血管內(nèi)皮細(xì)胞與血細(xì)胞均不能表達(dá)[9],因此生理?xiàng)l件下含量極低。TM是凝血酶受體,具有抗凝活性,由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成,是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子標(biāo)記[10]。

本研究中,寒潮組在寒潮時段TF和TM的含量均明顯增高。提示寒冷刺激使血管收縮,若損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞或使粥樣硬化斑塊破裂時,血漿中TM水平可增高[11],抗凝作用增強(qiáng),局部微環(huán)境凝血、抗凝作用平衡被打破,導(dǎo)致局部組織出血;同時作為機(jī)體的代償調(diào)節(jié),具有拮抗作用的TF由巨噬細(xì)胞及碎片大量釋放入血,可啟動外源性凝血途徑發(fā)揮生理性止血作用[12]。由于長期持續(xù)高血壓可能影響機(jī)體的凝血/纖溶系統(tǒng)及血管舒縮反應(yīng)能力[13,14],致相應(yīng)的應(yīng)激調(diào)控功能降低。經(jīng)歷寒潮刺激,收縮/舒張或凝血/抗凝系統(tǒng)可能均被激活,ET、CGRP、TF和TM的含量增高使局部微環(huán)境發(fā)生變化,局部內(nèi)環(huán)境失去穩(wěn)態(tài),從而有誘發(fā)腦卒中發(fā)生的可能。提示寒潮可能通過上述因子動態(tài)變化或調(diào)節(jié)紊亂促使腦卒中的發(fā)生。所以在臨床上建議高血壓患者在冬季應(yīng)有效地預(yù)防突發(fā)寒冷刺激,并采取適宜的措施,以減少或避免發(fā)生腦卒中。

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