牛乳中乳鐵蛋白的分離純化

肖嵐，張振宇，王熙，辛松林

（四川烹飪高等?？茖W(xué)校，四川成都610072）

牛乳中乳鐵蛋白的分離純化

肖嵐，張振宇，王熙，辛松林

（四川烹飪高等?？茖W(xué)校，四川成都610072）

采用強(qiáng)陽離子交換色譜梯度洗脫法，對牛乳中的乳鐵蛋白進(jìn)行分離和純化，并利用SDS-PAGE定性檢測。結(jié)果表明：采用強(qiáng)陽離子交換色譜梯度洗脫法可較好地分離提取出乳鐵蛋白，分離出的乳鐵蛋白顯示為單一區(qū)帶，每毫升牛乳能提取乳鐵蛋白0.23 mg，純度為95%。

乳鐵；分離；純化；牛乳

Abstract:A gradient elution procedure for isolation and purification of lactoferrin by strong cation exchange chromatography in this paper,and lactoferrin was analyzed qualitatively by SDS-PAGE.The result shows that lactoferrin could be isolated and purificated by strong cation exchange chromatography in this paper,the isolated lactoferrin as a single band in SDS-PAGE,lactoferrin could be obtained 0.23 mg from per milliliter bovine milk and the purity was 95%.

Key words：lactoferrin;isolation;purification;bovine milk

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種相對分子量約為80000 u的鐵結(jié)合性糖蛋白，主要存在于乳汁、眼淚、唾液、精液、鼻腔分泌物等外分泌液或血漿、中性粒細(xì)胞中。乳汁，尤其是初乳中LF的含量很高，如牛初乳中的LF質(zhì)量濃度為1 g/L[1]。Groves[2]于1960年首次從牛乳中分離獲得LF，由于LF與鐵結(jié)合形成紅色的復(fù)合物，故也稱其為“紅蛋白”。LF功能廣泛，具有廣譜抗菌、抗病毒感染作用，能調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡，促進(jìn)骨髓細(xì)胞生成，促進(jìn)細(xì)胞生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗病能力，抑制人體腫瘤細(xì)胞作用，能與多種抗生素及抗真菌制劑協(xié)同作用，更有效治療疾病[3-4]。由此可見，乳鐵蛋白可廣泛應(yīng)用于食品、生化、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

自1960年以來,人們就嘗試采用各種方法制備乳鐵蛋白，例如采用色譜法、超濾法、鹽析法以及酸沉淀法等從人或牛乳中分離純化LF[5]。Groves利用DEAE纖維素陰離子交換樹脂分離出較純的乳鐵蛋白，此后他又開發(fā)出磷酸纖維素交換色譜法，并由Foley加以改進(jìn)，得到乳鐵蛋白的純度為81%左右。羧甲基陽離子交換色譜法被應(yīng)用于乳鐵蛋白和乳過氧化氫酶的分離，用pH值為7.7，濃度為0.05 mol/L磷酸鈉或濃度為0.3 mol/L的NaCl洗脫液洗脫，它可把乳鐵蛋白分為a，b 2種變異體。樹脂能用濃度為0.2 mol/L的NaOH和濃度為0.2 mol/L的HCl再生，此法較DEAE纖維法更有效[6-8]。

本研究采用強(qiáng)陽離子交換色譜梯度洗脫法，成功地從牛乳中分離出了高純度的乳鐵蛋白，并對此分離過程做了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，從而為LF的大規(guī)模開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)牧場；TOYOPEARL SP-650M離子交換劑：Toyosoda,Tokyo,Japan；SDS-PAGE 試劑（電泳級）：日本分裝；牛血清白蛋白：上海伯奧生物科技有限公司；凝乳酶：廣州裕力寶生物科技有限公司；其它試劑均為分析純：國產(chǎn)。

1.2 儀器

層析柱Φ1.6×20 cm：國產(chǎn)；微濾器、微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）：上海興亞凈化器材廠；玻璃濾過裝置（濾板孔徑 7 μm~16 μm）：長春市玻璃儀器廠；751-GW分光光度計：上海分析儀器廠；Mini-Protean3垂直板電泳儀：Bio-RAD公司；BS-100A自動部分收集器、BT-200B數(shù)顯恒流泵：上海滬西分析儀器廠；冷凍離心機(jī)：Thermo；79-1磁力加熱攪拌器：金壇市富華儀器有限公司；2X2-2型旋片真空泵：浙江黃巖求精真空泵廠。

1.3 方法

1.3.1 牛乳的預(yù)處理[9]

除奶油：從牧場取回鮮牛乳，用4層消毒紗布過濾，除去大部分雜質(zhì)；然后用離心機(jī)分離脫脂（797r/min，20 min，30℃～40℃）；脫脂乳經(jīng)抽濾除去大的脂肪球。

除酪蛋白：脫脂乳水浴加熱至34℃，加入0.1 g凝乳酶于1 L脫脂乳中，攪拌均勻，34℃凝乳1 h，分離出乳清；乳清經(jīng)抽濾除去大的酪蛋白顆粒，濾液離心（3985 r/min，25 min，4℃）去除小的酪蛋白顆粒，得到澄清的乳清。

超濾：乳清用0.45 μm濾膜過濾，去除小的脂肪球、不溶性蛋白質(zhì)和乳糖等小分子雜質(zhì)。

濃縮：膜過濾后的乳清經(jīng)透析濃縮，便于進(jìn)一步純化。

1.3.2 離子交換層析[9]

TOYOPEARL SP-650M（Toyosoda，Tokyo，Japan）被準(zhǔn)備作為強(qiáng)陽離子交換層析填料，填柱1.5 cm×18 cm。先用pH6.6、0.05 mol/L磷酸鈉起始緩沖液平衡離子交換柱和試樣，未被吸附的蛋白質(zhì)被起始緩沖液洗脫，被吸附的蛋白質(zhì)用NaCl溶液梯度洗脫，即pH6.6、0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液和 0 mol/L～1 mol/L NaCl溶液連續(xù)梯度洗脫2 h，流速為4.0 mL/min。各個洗脫峰分別收集，在280 nm下測定其吸光度值（OD280），并繪制洗脫曲線。

1.3.3 LF的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳（SDSPAGE電泳）[10]

分離膠緩沖液 1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.8）；濃縮膠緩沖液 1 mol/L Tris.HCl緩沖液（pH6.8）；單體29%（W/V）Acr+1%（W/V）Bis；電極緩沖液 25 mmol/L Tris，0.25 mol/L 甘氨酸，含 0.1%（W/V）SDS，pH8.3；聚合起始劑新鮮配制的10%過硫酸銨溶液；聚合促進(jìn)劑TEMED；染色液0.25%（W/V）考馬斯亮蘭R-250，45%（V/V）甲醇，10%（V/V）冰醋酸：脫色液 10%（V/V）乙醇，35%（V/V）甲醇。垂直板電泳分離膠和濃縮膠的組成見表1。

表1 分離膠和濃縮膠的組成Table 1 Constitutes of separating gel and concentrating gel

電泳條件：恒流10 mA。

相對遷移率（Rf）的計算：

Rf=蛋白質(zhì)樣品距加樣端的距離/溴酚藍(lán)帶距加樣端的距離

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定

考馬斯亮藍(lán)染色法[10]。牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0588X+0.0106,相關(guān)系數(shù)為0.9943。

2 結(jié)果與討論

2.1 LF的提取

從牛乳中提取LF可分為4個步驟：（1）離心分離脫脂得到脫脂牛乳；（2）凝乳酶凝乳除酪蛋白得乳清；（3）乳清經(jīng)膜過濾除去不溶性蛋白質(zhì)、乳糖等小分子雜質(zhì)；（4）膜過濾乳清經(jīng)透析濃縮除去大部分的水。

提取過程中蛋白質(zhì)含量的變化見表2。

表2 提取過程中蛋白質(zhì)含量變化Table 2 Variation of protein content during extraction

據(jù)文獻(xiàn)報道，乳中蛋白質(zhì)含量為2.9%～4.5%，平均為3.4%，其中酪蛋白為2.9%，乳清蛋白為0.5%[11]。由表2可知，脫脂過程除去大部分脂肪，蛋白質(zhì)損失較少；酪蛋白沉淀分離得乳清后，蛋白質(zhì)總量下降明顯，說明乳中酪蛋白含量較多；乳清經(jīng)膜過濾除去不溶性蛋白質(zhì)等小分子雜質(zhì)，蛋白質(zhì)含量略有降低，離心超濾過程中分子量為90000 u以下的低分子蛋白質(zhì)可能透過超濾膜，分子量為150000 u以上的蛋白質(zhì)被截留而除去；乳清經(jīng)透析濃縮，蛋白質(zhì)含量明顯增加，這是由于用截留分子量12000 u的透析袋除去了鹽和大量的水，蛋白質(zhì)被濃縮。

2.2 LF的分離純化

起始緩沖溶液pH的選擇決定于被分離物質(zhì)的等電點、穩(wěn)定性和溶解度，也受離子交換劑的影響。本文研究起始緩沖液即磷酸鹽緩沖液pH值分別為6.4、6.6、7.0對乳鐵蛋白純化的影響。

在上樣前用pH分別為6.4、6.6、7.0的0.05 mol/L磷酸鈉起始緩沖液平衡陽離子交換層析柱，上樣后再用起始緩沖液平衡至基線，最后用0 mol/L～1 mol/L NaCl（起始緩沖溶液中）進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果見圖2~圖4。

由圖2~圖4可知，梯度洗脫前，未被離子交換劑吸附的大量雜蛋白已流出；根據(jù)采用不同pH的起始緩沖液，梯度洗脫得到的洗脫峰不同，pH6.4和7.0的起始緩沖液分離得到2個洗脫組分，分別為乳過氧化物酶、LF，即LF-α和LF-b沒有完全得到分離；而pH6.6的起始緩沖液分離得到3個洗脫組分，分別為乳過氧化物酶、LF-α及LF-b。

由此可見，離子交換所需的起始緩沖液pH值一定要選擇合適，緩沖液pH值不能與LF的等電點相差太小也不能相差太大，它會導(dǎo)致將所有蛋白質(zhì)都不加選擇地洗脫下來，從而影響LF的純度和得率，綜合考慮離子交換后洗脫峰蛋白質(zhì)的量及乳鐵蛋白的純度，起始緩沖液pH值為6.6最佳。

不同條件下進(jìn)行離子交換層析，分別收集其目標(biāo)洗脫峰，用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量，計算乳鐵蛋白的量，結(jié)果見表3。

表3 上樣緩沖液pH值對目的峰中乳鐵蛋白量的影響Table 3 Affect of pH of buffer on LF content in objective peak

由表3可知，pH6.6時洗脫出來的目的峰中乳鐵蛋白量最高，pH6.4時次之，pH7.0時最低。

2.3 LF的SDS-PAGE電泳

標(biāo)準(zhǔn)蛋白、收集的LF，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，電泳圖譜見圖5；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與相對遷移率之間的關(guān)系如圖6所示。

從圖5可以看出，分離出的LP為單一區(qū)帶，已達(dá)電泳純，經(jīng)計算其相對分子質(zhì)量為80920 u，試驗結(jié)果與文獻(xiàn)中報道的LF相對分子質(zhì)量為80000 u左右一致，對電泳凝膠進(jìn)行掃描和數(shù)據(jù)分析，LF的純度為95%。

3 結(jié)論

牛乳經(jīng)離心脫脂、酶凝乳除酪蛋白后，通過強(qiáng)陽離子交換色譜梯度洗脫分離純化得到LF，洗脫條件確定為：上樣量10 mL，pH 6.6,濃度為0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液進(jìn)行平衡洗脫，濃度為0 mol/L～1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。

利用考馬斯亮藍(lán)、SDS-PAGE電泳定性定量檢測。結(jié)果表明：每毫升牛乳能提取乳鐵蛋白0.23 mg，純度為95%。

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Isolation and Purification of Lactoferrin in Bovine Milk

XIAO Lan,ZHANG Zhen-yu,WANG Xi,XIN Song-lin
（Sichuan Higher Institute of Cuisine，Chengdu 610072，Sichuan,China）

2010-04-30

基金來源：四川省教育廳青年基金項目（09ZB057)；成都大學(xué)肉品重點實驗室一般項目（10R06）

肖嵐（1981—），女（漢），助教，研究生，從事食品加工方面研究。