食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)

李睿，戴詩(shī)皎，楊敬鏡，瞿敏，劉志國(guó)

（武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的多重PCR檢測(cè)

李睿，戴詩(shī)皎，楊敬鏡，瞿敏，劉志國(guó)

（武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

針對(duì)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的stx2、wzy、hlyA的保守序列，設(shè)計(jì)特異性的引物，建立一種新的多重PCR檢驗(yàn)方法。結(jié)果顯示，該方法特異性強(qiáng)，擴(kuò)增結(jié)果與各參考菌株基因型一致，并能良好的區(qū)分出O157菌株和非O157型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌。該方法能用于食品樣品的檢測(cè)和流行病學(xué)分離株的快速鑒定。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌；多重PCR；hlyA；stx2；wzy

Abstract:Specific primers were designed according to the conserved loci of stx2,wzy and hlyA genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）.A Multiplex PCR method was then developed.The result demonstrated that this method was highly specific.It detected the presence of the three target genes in a manner consistent with the known genotype of each reference strain.O157 and non-O157 STEC strains could also be well distinguished.The multiplex PCR developed in this study could be used for mass screening of food samples,and identification of clinical STEC isolates.

Key words：Shiga toxin-producing Escherichia coli;multiplex PCR;hlyA;stx2;wzy

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC；或稱(chēng) Vero toxin-producing Escherichia coli,VTEC）是食品主要病原菌之一[1]。STEC 包括 O157：H7、O157：H- 、O6、O26、O111、O91 等血清型[2]。世界上許多國(guó)家相繼發(fā)生了STEC的感染流行，對(duì)食品安全造成嚴(yán)重危害[3]。STEC主要毒力因子是stx1、stx2基因，分別編碼志賀毒素1和志賀毒素2。兩種毒素毒力不同，志賀毒素2比志賀毒素1毒力更強(qiáng),更易引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥等食物中毒并發(fā)癥[4]。大質(zhì)粒上編碼溶血素的hlyA基因亦是STEC重要毒力因子[5]。目前STEC的檢測(cè)是一個(gè)難點(diǎn)。以O(shè)157特異的標(biāo)志基因-O抗原聚合酶基因wzy和stx2、hlyA基因開(kāi)發(fā)多重PCR檢測(cè)技術(shù)，為檢測(cè)食品中的STEC菌株提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

大腸桿菌 O157：H7 EC1、EC2、EC3：均為日本九州大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；大腸桿菌O157：H7 EC4號(hào)菌株、單核增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌：武漢市疾病預(yù)防控制中心提供；大腸桿菌O157：H7 EC5號(hào)菌株、普通大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌由武漢工業(yè)學(xué)院食品安全實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

CT-SMAC培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；新生霉素：上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司；GoldView核酸染料：上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；AxyPrep細(xì)菌基因組試劑盒、Taqmix預(yù)混合PCR試劑盒武漢華順生物技術(shù)有限公司；DNA marker、引物合成：武漢鼎國(guó)生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

將O157菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后用AxyPrep細(xì)菌基因組試劑盒提取DNA。

1.2.2 多重PCR檢測(cè)體系

PCR 體系為：8 μL dd H2O,12.5 μL 2×Taqmix 混合液，10 μM wzy 上下游引物各 1 μL,10 μM stx2 上下游引物各 0.5 μL,10 μM hly 上下游引物各 0.25 μL,1 μL DNA。PCR擴(kuò)增程序：94℃變性1 min,55℃45 s，72℃60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 多重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)室保存的各種菌株提取DNA，做多重PCR檢測(cè)，確定引物的特異性。

1.2.4 多重PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

用大腸桿菌EC1號(hào)菌株DNA為模板，梯度系列稀釋后，做多重PCR檢測(cè)，確定靈敏度。

1.2.5 人工染菌樣品實(shí)驗(yàn)

將EC1號(hào)菌株LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)16 h～20 h，然后10倍梯度稀釋。取100 μL梯度稀釋菌液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)取無(wú)大腸桿菌O157感染的新鮮牛肉25 g,將牛肉均質(zhì)，加入10－1梯度稀釋菌液，振蕩混合0.5 h。取1 mL混合液，離心后用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA試劑合提取DNA。然后梯度稀釋?zhuān)M(jìn)行多重PCR，確認(rèn)檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR引物設(shè)計(jì)

在 NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載wzy和stx2基因序列，在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)引物。hlyA基因引物參照文獻(xiàn)[6]。引物對(duì)見(jiàn)表1。

表1 多重PCR引物序列信息Table 1 Sequences of primers in the multiplex PCR

2.2 多重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

前期研究結(jié)果表明，大腸桿菌O157：H7 EC1、EC2、EC3、EC4、EC5 號(hào)菌株均攜帶兩種志賀毒素和hlyA基因，多重PCR檢測(cè)結(jié)果與之一致，3組引物擴(kuò)增均能得到預(yù)期PCR產(chǎn)物，見(jiàn)圖1。單核增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌、普通大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等則呈陰性結(jié)果（圖片未附），表明多重PCR特異性強(qiáng)。

2.3 多重PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

用純菌DNA做多重PCR靈敏度驗(yàn)證試驗(yàn)，DNA濃度為1.88 ng/μL時(shí)，3組基因都能良好擴(kuò)增出。DNA濃度持續(xù)降低，stx2、wzy引物對(duì)靈敏性下降，但hlyA基

2.4 人工染菌樣品試驗(yàn)

當(dāng)稀釋度為10－5時(shí)，stx2、wzy基因有模糊的產(chǎn)物條帶。稀釋度為10－9時(shí)，仍可檢測(cè)hlyA基因,對(duì)應(yīng)平板菌落計(jì)數(shù)為平板菌落計(jì)數(shù)為1.2 cfu/mL。將3組基因均能獲得良好擴(kuò)增的對(duì)應(yīng)稀釋度作為檢測(cè)的最高靈敏度，則多重PCR檢測(cè)的最高稀釋度為10－5。每個(gè)稀釋度相應(yīng)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，稀釋度為10－5時(shí)，平板菌落計(jì)數(shù)為 1.2×104cfu/mL。

3 結(jié)論

STEC的檢測(cè)是一個(gè)難點(diǎn)，傳統(tǒng)檢測(cè)方法一般是通過(guò)平板分離出單菌落后，采用免疫試劑盒測(cè)定志賀毒素，或采用特異性核苷酸探針鑒定單菌落的stx基因[7]。STEC毒力復(fù)雜，大質(zhì)粒上編碼溶血素的hlyA基因、編碼緊密粘附素的eae基因等，可增強(qiáng)STEC的毒力[7]。此種檢測(cè)STEC的多重PCR技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)stx2、hlyA兩種毒力基因和wzy基因。O抗原聚合酶基因wzy基因是O157血清型大腸桿菌的特異基因，可鑒別出O157菌株。O157是STEC最主要的血清型，也是STEC最常見(jiàn)的引起食物中毒的血清型。通過(guò)擴(kuò)增這三組基因，不僅可區(qū)分出O157，還可鑒定出菌株的毒力情況，為流行病學(xué)研究和食品安全控制提供更全面的信息。本文報(bào)道的多重PCR技術(shù)，能滿(mǎn)足實(shí)際檢驗(yàn)要求。多重PCR引物之間容易相互干擾，形成引物發(fā)夾環(huán)或引物二聚體，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低。多重PCR體系中hlyA基因擴(kuò)增優(yōu)于另兩組基因，可在后續(xù)試驗(yàn)中繼續(xù)優(yōu)化PCR體系和反應(yīng)條件，以進(jìn)一步提高stx2和wzy基因的檢測(cè)靈敏度。

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A Multiplex PCR System for the Detection of Shiga Toxin-producing Escherichia Coli in Food

LI Rui,DAI Shi-jiao,YANG Jing-jing,Qü Min，LIU Zhi-guo
（College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei,China）

2010-04-13

李睿（1972—），女（土家），副教授，博士，現(xiàn)從事食品安全方向研究工作。