采后厚樸提取物處理對桃果實抗病性的影響

張 莉，馮曉元，王政軍，李文生，王寶剛，楊軍軍

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院食品系，山東萊陽265200；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京100093；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，山東青島266109）

采后厚樸提取物處理對桃果實抗病性的影響

張 莉1，馮曉元2，*，王政軍3，李文生2，王寶剛2，楊軍軍2

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院食品系，山東萊陽265200；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京100093；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，山東青島266109）

以“八月脆”桃為試材，通過損傷接種研究了采后厚樸提取物處理對桃果實采后病害的控制和抗病性酶的影響。結(jié)果表明：采收后用3.13、6.25、12.50mg/mL的厚樸提取物處理桃果實，十分有效地抑制了桃果實接種的褐腐?。∕onilinia.fracticola）的發(fā)生；并且明顯誘導(dǎo)了果實中苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶和!-1，3-葡聚糖酶等抗性相關(guān)酶活性。

厚樸提取物，桃，苯丙氨酸解氨酶，幾丁質(zhì)酶，!-1，3-葡聚糖酶

Abstract：In this paper，control of postharvest diseases of peach fruit（ Prunus persica cv.“ Bayuecui”）by postharvest infiltration inoculation or dipping of Cortex Magnolia Officinalis extract was investigated，and effects of these treatments on defense enzymes of peaches were also evaluated.The results indicated that 3.13mg/mL，6.25mg/mL and 12.50mg/mL Cortex Magnolia Officinalis extract treatment showed the significantly inhibitory effects in inoculated diseases of Monilinia.fracticola rot in peach fruit.And Cortex Magnolia Officinalis extract treatment effectively enhanced the activities of defense enzymes including phenylalanine ammonia-lyase（PAL），chitinase（CHT）and β-1，3-glucanase（GLU）of peach fruit.

Key words：Cortex Magnolia Officinalis extract；peach；phenylalanine ammonia-lyase；phitinase；β-1，3-glucanase中圖分類號：TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002-0306（2010）10-0136-03

在水果采后貯藏、加工和運銷過程中，經(jīng)常由于病原微生物侵染引起水果大量腐爛，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前主要依靠使用人工合成的化學(xué)殺菌劑控制水果采后病害，但是由于病原菌抗藥性問題和藥劑殘留問題，使用殺菌劑控制果實采后病害受到了越來越多的限制，尋找更加安全、有效的控制水果采后病害的方法就顯得十分重要。中藥厚樸是木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）的樹皮、根皮或枝皮，是我國重要的傳統(tǒng)中藥［1］。厚樸中含有厚樸酚、各種揮發(fā)油類、生物堿以及少量皂苷、鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分，其中以厚樸酚為主要有效成分，約占原藥材的5%～12%。厚樸提取物作為一種中草藥保鮮劑，不僅可減輕水果采后腐爛，延長采后壽命［2］，而且無毒、無污染、無殘留，符合綠色食品的要求，但除了知道其有抑菌作用外［2-3］，對其它的作用機(jī)制還缺乏深入的了解。因此，本文主要研究了采后厚樸提取物處理對桃果實褐腐菌（Monilinia fructicola）的控制效果以及誘導(dǎo)桃果實抗病性酶的情況，以此了解厚樸提取物在控制病害方面的可能作用機(jī)制，為生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

八月脆桃（Prunus persica cv.Bayuecui） 采自北京市平谷區(qū)王辛莊鎮(zhèn)許家務(wù)果園，果實采收當(dāng)天運回實驗室；厚樸提取物 標(biāo)準(zhǔn)制備工藝生產(chǎn)的褐色粉末，含5%～12%厚樸酚，由北京市農(nóng)科院林業(yè)果樹研究所提供，經(jīng)北京市疾病預(yù)防控制中心檢測證明其無毒、無刺激性，可以安全用于食品；褐腐病菌（Monilinia fracticola） 由中國科學(xué)院植物研究所提供，在馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 厚樸提取物處理 分別配制濃度為3.13、6.25、12.50mg/mL的厚樸提取物溶液（用2%NaHCO3溶液調(diào)節(jié)所配制溶液的pH為7.0），浸泡果實5min，取出自然晾干。然后將果實放入0.03mm厚的聚乙烯保鮮袋中，內(nèi)加乙烯吸收劑（高錳酸鉀∶珍珠巖=0.68∶1），封口，在 0±0.5℃下貯藏，以清水處理為對照。在處理1周后，分別進(jìn)行接種實驗。每處理用果150個，重復(fù)3次。

1.2.2 病原菌及孢子懸浮液的制備 將褐腐菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃下恒溫培養(yǎng)7d，然后用含0.05%Tween80的無菌水制成濃度約為5×104個/mL的孢子懸浮液。懸浮液孢子計數(shù)采用血球計數(shù)板法。

1.2.3 接種方法 選擇外觀整齊、無病蟲害和機(jī)械損傷的桃果實，用接種針在果實胴部刺1個3mm（寬）×4mm（深）的傷口，將傷口表面晾干，接種褐腐病菌懸浮液15!L。傷口晾干后將果實放在300mm×200mm×100mm的塑料包裝盒中，外套一塑料袋以保持相對濕度在95%左右，存放于25℃恒溫下。每天統(tǒng)計果實發(fā)病率，利用十字交叉法測量病斑直徑。每處理用果30個，重復(fù)3次。在褐腐病發(fā)病過程中，定期（接種處理后 0、1、2、3、4d）取果實病斑周圍2cm內(nèi)健康果肉組織進(jìn)行PAL、CHT和GLU活性測定。

1.2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶液制備與活性測定參照 Assis 等［4］和吳芳芳等［5］的方法，加以改進(jìn)。從6個果實中取5.0g果肉樣品，加入10mL經(jīng)4℃預(yù)冷的0.1mol/L，pH8.8的硼酸緩沖液（含5mmol/L"-巰基乙醇，4%（w/v）PVP，2mmol/L EDTA），石英砂1g，于研缽中冰浴研磨成勻漿，然后于 4℃，12000r/min離心30min，上清液用于酶活性測定。PAL酶活性以U/gFW·h表示。

1.2.5 幾丁質(zhì)酶（CHT）和 "-1，3-葡聚糖酶（GLU）酶液制備與活性測定 從6個果實中稱取5.0g果肉，加入10mL 0.1mol/L，pH5.0的乙酸緩沖液（含5mmol/L"-巰基乙醇，4%（w/v）PVP和 1mmol/L EDTA），在冰浴條件下研磨勻漿，于4℃，12000r/min離心30min，棄去沉淀，上清液用于CHT和GLU酶活性測定。

CHT 活性測定：參照榮瑞芬等［6］和 Harman 等［7］的方法并加以改進(jìn)，以每秒鐘分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-6!g N-乙酰氨基葡萄糖為一個酶活性單位（U），酶活性以U/mg FW表示。GLU活性測定：參考 Abeles等［8］和 Reese 等［9］的方法并加以改進(jìn)，以每秒鐘分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-6!g葡萄糖為一個酶活性單位（U），酶活性以U/mg FW表示。

1.2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析 應(yīng)用SPSS 11.5軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），并利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后厚樸提取物處理對桃果實損傷接種褐腐病菌的影響

從圖1可以看出，采后厚樸提取物處理在常溫下對M.fructicola引起的桃果實褐腐病的發(fā)病率和病斑直徑均有很好的抑制效果，且隨濃度的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)。CK在接種后第2d就開始發(fā)病，并且發(fā)病率達(dá)到了83.33%；6.25、12.50mg/mL厚樸提取物處理的果實在第3d才開始發(fā)病，發(fā)病率分別為66.67%與33.33%，均顯著低于CK（100%）；其病斑直徑分別為16.1%和11.3%，也顯著小于 CK（51.4%），而且隨著培養(yǎng)時間延長，效果仍很明顯（P＜0.05）。這說明采后厚樸提取物處理一定程度上能推遲桃果實褐腐病的發(fā)生，并對病斑擴(kuò)展也有明顯的抑制作用。

圖1 采后厚樸提取物處理對桃果實損傷接種褐腐病菌發(fā)病率和病斑直徑的影響

2.2 采后厚樸提取物處理對桃果實苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

厚樸提取物處理以及損傷接種褐腐菌對桃果實PAL活性的影響如圖2所示。三個濃度厚樸提取物處理果實的PAL活性在整個實驗過程中均顯著高于CK（P＜0.05），并隨濃度的增大，升高效果越明顯。以6.25mg/mL處理為例，它在未接種M.fructicola（即桃果實接種后0d）時的PAL活性（23.20 U/g FW·h）比CK（16.73U/g FW·h）高出38.67%，在接種后第1d高出CK（10.70U/gFW·h）114.49%，并隨著培養(yǎng)時間延長，效果仍很明顯，到接種后第4d仍比 CK（19.20U/g FW·h）高58.59%，表明采后厚樸提取物處理能夠刺激桃果實中PAL活性增強(qiáng)。

圖2 采后厚樸提取物處理對發(fā)病過程中桃果實PAL活性的影響

2.3 采后厚樸提取物處理對桃果實幾丁質(zhì)酶（CHT）活性的影響

如圖3所示，厚樸提取物各處理與CK的CHT酶活性都是在接種1d后上升達(dá)到高峰，但三個濃度厚樸提取物處理的 CHT活性顯著高于 CK（P＜0.05），尤其是 6.25mg/mL處理的酶活峰值最大（18.83U/mg FW），比 CK（10.24U/mg FW）高出83.89%。在接種第 2、3、4d，雖然 CK 與 3.13、6.25、12.50mg/mL厚樸提取物處理果實的CHT活性變化趨勢相同，都是先下降后上升，但是CK的CHT活性明顯比三個處理的低，與之相比差異顯著（P＜0.05）。說明厚樸提取物誘導(dǎo)了桃果實中CHT活性的迅速升高，并且具有持久性。

圖3 采后厚樸提取物處理對發(fā)病過程中桃果實CHT活性的影響

2.4 采后厚樸提取物處理對桃果實β-1，3-葡聚糖酶（GLU）活性的影響

從圖4可看出，CK 與3.13、6.25、12.50mg/mL厚樸提取物處理果實的GLU活性在接種后第2d之前都是先上升后下降的，但是CK的GLU活性顯著小于三個濃度處理的（P＜0.05）。到了第3d，CK的GLU活性急劇下降達(dá)到最低點，而 3.13、6.25、12.50mg/mL厚樸提取物處理的GLU活性仍在繼續(xù)升高或僅有少許降低，比此時CK（322.40U/mg FW）分別高出了76.21%、125.31%和97.10%；到實驗結(jié)束即接種后第4d，仍分別顯著高于CK（P＜0.05），說明厚樸提取物很大程度上激活了桃果實中的GLU活性。

圖4 采后厚樸提取物處理對發(fā)病過程中桃果實GLU活性的影響

3 討論

植物的抗病性反應(yīng)中，抗性相關(guān)酶發(fā)揮了重要作用，這主要包括酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶和病程相關(guān)蛋白（PRs）家族。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、幾丁質(zhì)酶（CHT）及 β-1，3-葡聚糖酶（GLU）就是存在于植物體內(nèi)與抗病性有關(guān)的酶。PAL是苯丙烷類代謝中的關(guān)鍵酶和限速酶，由該途徑合成的中間產(chǎn)物酚類物質(zhì)以及木質(zhì)素和類黃酮類、植保素等都是植物體內(nèi)一些重要的抗菌物質(zhì)。CHT和GLU屬于病程相關(guān)蛋白的成員，可以降解病原菌細(xì)胞壁的主要組成成分幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖，使病原微生物的生長受到限制［6，10］，兩種酶還具有協(xié)同殺菌作用，當(dāng)兩者協(xié)同表達(dá)時，植物可以顯現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌活性。生物或非生物處理都可誘導(dǎo)植物防御酶活性提高，對此已有大量報道：拮抗菌處理可以誘導(dǎo)蘋果中PAL、CHT、GLU 等酶活性的提高［11］；UV-C 處理番茄后，誘導(dǎo) PAL活性的增加，激活了CHT、GLU 活性［6］；水楊酸（SA）可以誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白如CHT和GLU［12-13］；黃柏、虎杖提取物處理梨果實后，均對PAL、CHT和GLU活性有不同程度地誘導(dǎo)提高［14-15］等。然而，有關(guān)厚樸提取物誘導(dǎo)抗性酶活性變化方面的情況卻鮮有報道。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，桃果實接種褐腐菌后，厚樸提取物處理果實中苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶PAL活性明顯增強(qiáng)（圖2）；桃果實CHT和GLU活性在厚樸提取物處理后顯著升高（圖3和圖4）。相應(yīng)地，厚樸提取物處理后的桃果實增強(qiáng)了對病原菌侵染的抵抗能力，不同程度地降低了果實損傷接種M.fructicola后引起的褐腐病的發(fā)病率，減小了病斑直徑（圖1），說明桃果實經(jīng)厚樸提取物處理產(chǎn)生的抗病性與其誘導(dǎo)的PAL、CHT和GLU活性直接相關(guān)。

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Effect of Cortex Magno/ia Officina/is extract treatment on disease resistance of harvested peach fruit

ZHANG Li1，F(xiàn)ENG Xiao-yuan2，*，WANG Zheng-jun3，LI Wen-sheng2，WANG Bao-gang2，YANG Jun-jun2
（1.Food Department of Haidu College，Qingdao Agricultural University，Laiyang 265200，China；2.Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100093，China；3.Qingdao Agricultural University Library，Qingdao 266109，China）

2009-03-16 *通訊聯(lián)系人

張莉（1979-），女，碩士，助教，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工工作。

北京市科委基金課題（D0704002040431）。