蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖的分離純化及組成分析

任大明，李冬琦，勞云云

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110161）

蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖的分離純化及組成分析

任大明，李冬琦，勞云云

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110161）

為研究蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖的分離純化及組成，本實(shí)驗(yàn)利用水提醇沉法與Sevage法相結(jié)合，得到蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基粗多糖（CMSMP）。經(jīng)DEAE-cellulose 52柱層析分離得到純化蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖組分（CMSMP1）后，采用紫外光譜、醋酸纖維素薄膜電泳和Sephadex G-150凝膠柱層析鑒定其純度，高效液相色譜及紅外光譜分析其組成、結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，CMMSP1為均一多糖，且由木糖、阿拉伯糖和葡萄糖三種單糖組成。同時(shí)紅外光譜顯示，CMSMP1具有典型多糖吸收峰。

蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖，分離純化，純度鑒定，組成分析

Abstract：To study the purification and composition of polysaccharides from Cordyceps militaris solid fermentation medium，the crude polysaccharides（CMSMP）were obtained by water extraction and alcohol precipitation，then removal of protein by enzymatic hydrolysis and Sevage in this experiment.The deproteinated CMSMP were purified by DEAE-cellulose 52，and it was analyzed by the techniques of U∨，cellulose acetate membrane electrophoresis and Sephadex G-150.Composition was analyzed by HPLC and IR.The results showed that CMSMP1 was homogeneous polysaccharides which were composed of xylose，arabinose and glucose.IR showed CMSMP1 had a typical absorption peak of the polysaccharide.

Key words：Cordyceps militaris solid fermentation medium polysaccharide；isolation and purification；purity determination；composition analysis

維持生命所需生理功能息息相關(guān)的多糖是構(gòu)成生命活動四大基本物質(zhì)之一，是一種具有開發(fā)潛力的天然藥物化學(xué)成分。目前對多糖研究引起了學(xué)者的濃厚興趣，研究領(lǐng)域包括糖生物學(xué)、糖工程學(xué)等。同屬異種的蛹蟲草（C.militaris）［1］與冬蟲夏草有效成分種類及含量接近，但蛹蟲草多糖研究甚少。在蟲草多種生理活性物質(zhì)中，多糖具有多種生物活性，具有廣泛的藥理作用。為此，對蛹蟲草培養(yǎng)及活性成分研究與日俱增。1992年，蓋新杰等［2］從蛹蟲草菌體培養(yǎng)液中提取含有少量蛋白的半乳甘露糖。1997年，李信等［3］發(fā)現(xiàn)蛹蟲草胞外多糖具有良好的抗逆性及抗氧化活性。2003年，賓文等［4］研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖具有體液免疫及紅細(xì)胞免疫增強(qiáng)作用。同時(shí)，蛹蟲草多糖還具有促進(jìn)SOD酶活力的作用。為進(jìn)一步發(fā)掘具有潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值的蛹蟲草多糖，本實(shí)驗(yàn)對蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖進(jìn)行分離純化后，應(yīng)用紫外吸收光譜、高效液相色譜和紅外光譜對其單糖組成和簡單結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析和鑒定，為蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草固體培養(yǎng)基 由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所提供；DEAE-cellulose 52、Sephadex G-150、木瓜蛋白酶、苯酚、硫酸、氯仿、正丁醇、氯化鈉、甲苯胺藍(lán)、三氟乙酸等 均為國產(chǎn)分析純。

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，TGL-10C高速臺式離心機(jī)，DHL-A電腦恒流泵，SBS-100自動部分收集器，UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，DYY-Ⅲ型電泳槽，Equinox 55紅外光譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖的分離純化水提醇沉法提取得到蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基粗多糖［7］。采用木瓜蛋白酶與 Sevag法［5］相結(jié)合除蛋白，得到精制蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖CMSMP。利用DEAE-cellulose 52［6-7］分級，最終得到純化蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖組分。

1.2.2 蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖分級組分的純度鑒定［8-9］采用紫外光譜掃描法、醋酸纖維薄膜電泳法及Sephadex G-150凝膠柱層析法對蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖分級組分的純度進(jìn)行鑒定。

1.2.3 蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖分級組分的單糖組成分析

1.2.3.1 多糖的完全水解［6］取10mg CMSMP1于一安瓿管中，加入4mL 2mol/L的三氟乙酸，封管，110℃水解6h，于40℃將三氟乙酸蒸干，加入4mL甲醇，蒸干，重復(fù)3～5次，加入1mL蒸餾水溶解，用于高效液相色譜分析。

1.2.3.2 高效液相色譜（HPLC）分析 色譜條件為：流動相：乙腈∶水 =90∶10；流速：0.8mL/min；固定相：氨基柱（3.0×150mm）；檢測器：島津SPD-10A型示差折光率檢測器；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5!L。

1.2.4 蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖分級組分的紅外光譜（IR）分析 取2mg CMSMP1，用KBr研磨壓片后，在4000～400cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMSMP的分離純化

采用DEAE-cellulose 52柱層析對CMSMP進(jìn)行分級，其洗脫曲線如圖1所示。經(jīng)蒸餾水，0.1、0.3、0.5、1.0mol/L NaCl洗脫后（分別對應(yīng) 1～24，25～48，49～72，73～96，97～120 管），得到2 個(gè)多糖洗脫峰，分別為CMSMP1、CMSMP2，根據(jù)其含量，收集主要級分CMSMP1。

圖1 CMSMP的DEAE-cellulose 52柱層析洗脫曲線

2.2 CMSMP1的純度鑒定

2.2.1 CMSMP1的紫外光譜掃描 CMSMP1在200～400nm的紫外掃描圖譜見圖2。在260、280nm處均無吸收，說明多糖中無蛋白質(zhì)、多肽及核酸。

2.2.2 CMSMP1的醋酸纖維薄膜電泳 CMSMP1的醋酸纖維薄膜電泳結(jié)果見圖3。顯示一個(gè)斑點(diǎn)，說明CMSMP1在組成上較唯一，是一種多糖純品。

2.2.3 CMSMP1的Sephadex G-150凝膠柱層析CMSMP1經(jīng)過Sephadex G-150凝膠柱層析，洗脫曲線為單一狹窄的對稱洗脫峰（圖4），結(jié)合紫外吸收光譜及醋酸纖維薄膜電泳結(jié)果，說明CMSMP1級分為多糖純品，可進(jìn)行性質(zhì)和結(jié)構(gòu)研究。

圖2 CMSMP1的紫外光譜圖

圖3 CMSMP1的醋酸纖維素薄膜電泳圖

圖4 CMSMP1的Sephadex G-150凝膠柱層析洗脫曲線

2.3 CMSMP1的單糖組成

從圖5中可以看出，與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對比，CMSMP1完全酸水解含有3種單糖：D-木糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖，其摩爾比為 1∶0.26∶4.62，可見蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖CMSMP1是一種由3種單糖組成的雜多糖。

圖5 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）及CMSMP1水解樣品（B）的高效液相色譜圖

2.4 CMSMP1的紅外光譜（IR）分析

CMSMP1 在 3412.0、2928.0、1639.4、1381.7、1041.3、579.8cm-1處出現(xiàn)多糖特征吸收峰（圖6）。據(jù)相關(guān)資料報(bào)道，3600～3200cm-1為糖類O-H鍵的伸縮振動，表明多糖存在分子內(nèi)和分子間的氫鍵；3000～2800cm-1的吸收峰是C-H鍵的伸縮振動，為糖類的特征吸收峰；2928.0cm-1為糖類C-H伸縮吸收峰；1639.4cm-1為 CHO的 C=O鍵的伸縮振動；1455～1327cm-1出現(xiàn)的多個(gè)峰為C-H變角振動吸收峰，這組峰是糖類的特征吸收峰；1200～1000cm-1之間的吸收峰是由兩種C-O鍵伸縮振動所形成，其中一種屬于C-O-H鍵，另一種是糖環(huán)的C-O-C鍵。

圖6 CMSMP1的紅外吸收圖譜

3 討論

1969年，日本人發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的真菌多糖，掀起了從真菌中尋找抗腫瘤成分的高潮［10］。目前，蛹蟲草中多糖形成途徑和機(jī)理及提高產(chǎn)量因素尚不明確。蛹蟲草多糖產(chǎn)量一直沒有得到明顯提高。蟲草具有提高免疫力、抗癌及保肝等功效，越來越受到人們重視。蛹蟲草產(chǎn)量的增加及明確其活性物質(zhì)的生物合成途徑、機(jī)理和調(diào)控等已成為急待解決問題，那么，在問題尚未解決之前是否可以充分利用現(xiàn)有資源變廢為寶？基于此，本實(shí)驗(yàn)將蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基殘?jiān)M(jìn)行再次利用，提取分離得到木糖、阿拉伯糖、葡萄糖3種單糖成分，避免了蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基的浪費(fèi)。應(yīng)用水提醇沉法提取蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖，用木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法除蛋白，經(jīng)過離子交換層析進(jìn)行純化，得到一種不含蛋白、純度較高的蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基多糖CMSMP1。高效液相色譜分析顯示，CMSMP1含有木糖、阿拉伯糖、葡萄糖3種單糖成分；紅外光譜分析進(jìn)一步證明了其具有糖類特征吸收峰。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用DEAE-cellulose 52柱層析，能夠有效地對蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中多糖進(jìn)行組分分離，并取得了較好的分離效果，為進(jìn)一步充分利用蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中有效資源并深入研究其詳盡結(jié)構(gòu)和生物活性等提供了理論依據(jù)。

［1］車振明.蟲草多糖生物活性研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景［J］.食用菌，2004（6）：3-5.

［2］蓋新杰，張翼伸.蛹蟲草胞外多糖的研究［J］.真菌學(xué)報(bào)，1992，11（4）：300-307.

［3］李信，許雷.蛹蟲草菌產(chǎn)生的胞外多糖及其理化性能和抗氧化活性的初步研究［J］.微生物學(xué)雜志，1997，17（3）：13-16.

［4］賓文，宋麗艷，等.人工培養(yǎng)蛹蟲草多糖的抗炎及免疫作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，14（1）：1-2.

［5］徐建祥，晏志云，趙謀明，等.酶法脫蛋白技術(shù)用于螺旋藻多糖提取工藝的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，24（3）：24-28.

［6］顧林，姜軍.山藥多糖的分離純化及組成研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（9）：158-161.

［7］杜志強(qiáng).猴頭多糖發(fā)酵生產(chǎn)及其生物學(xué)功能研究［D］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2007.

［8］申明月，聶少平，謝明勇.茶葉多糖的純化及其光譜特性研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（11）：39-43.

［9］張凱，戴玲，鄭子瑞.仙鶴草多糖的分離純化及理化性質(zhì)研究［J］.中國生化藥物雜志，2008，29（3）：171-174.

［10］唐茂芝，貝峰.食用菌類作為功能性食品的優(yōu)勢和特點(diǎn)［J］.食品科技，1999（3）：5-6.

Purification and composition analysis of polysaccharides from Cordyceps mi/itaris solid fermentation medium

REN Da-ming，LI Dong-qi，LAO Yun-yun
（College of Biological Science and Technology，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110161，China）

TS201.2+3

A

1002-0306（2010）10-0121-03

2009-10-15

任大明（1959-），男，博士，教授，研究方向：酶工程與微生物。