產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選、鑒定與應(yīng)用研究

孫 濤，江 波，*，潘蓓蕾，Rebaone Letsididi

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會，北京100006）

產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選、鑒定與應(yīng)用研究

孫 濤1，江 波1，*，潘蓓蕾2，Rebaone Letsididi1

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會，北京100006）

利用產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）菌株快速篩選法結(jié)合蘆丁轉(zhuǎn)糖基酶反應(yīng)，篩選獲得一株所產(chǎn)CGTase可高效轉(zhuǎn)化蘆丁的菌株。16S rRNA鑒定表明，此菌株和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）有100%的同源性。結(jié)合形態(tài)和生理生化鑒定，確定此菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus licheniformis SK13.002。該菌株在pH約為10時生長良好，且具有最高的產(chǎn)酶量，顯示其嗜堿性。此菌株所產(chǎn)酶以淀粉作底物所產(chǎn)環(huán)糊精為β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，其中β-環(huán)糊精所占比例為83.3%；兩者產(chǎn)量分別達到20.9g/L和4.2g/L。直接利用濃縮酶液進行蘆丁的糖基化，則可以得到近70%的轉(zhuǎn)化率。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，菌株，篩選，鑒定，應(yīng)用

Abstract：Using rapid screening method combined with enzymatic transglycosylation reaction of rutin，a microbial strain producing cyclodextrin glucanotransferase（CGTase）with highly efficient transglycosylation of rutin was isolated from soil.Through morphological，biochemical，physiological and 16S rRNA analyses，this strain was identified as Bacillus licheniformis SK13.002 with a 100%identity.This strain grew well and produced the largest amount of CGTase at a pH around 10 indicating that it was alkaliphilic.The CGTase from this strain was utilized to convert 5%of soluble starch and the results revealed that the enzyme produced mainly β-CD at 83.3%of the total CDs yield and no α-CD was formed after 24h of reaction.The produced β-and γ-CDs corresponded to 20.9g/L and 4.2g/L，respectively.The enzyme was also used to carry out transglycosylation reaction of rutin；under the optimized enzymatic reaction conditions，conversion rate of rutin reached near 70%.

Key words：cyclodextrin glucanotransferase；Bacillus licheniformis；screening；identification；application

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）為食品工業(yè)中的重要酶。CGTase催化4種不同的酶反應(yīng)，分別為水解、環(huán)化、歧化和偶聯(lián)反應(yīng)［1］。CGTase通過環(huán)化作用可轉(zhuǎn)化淀粉生成環(huán)糊精，根據(jù)葡萄糖殘基的不同，分別稱作 α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和 γ-環(huán)糊精［2］。環(huán)糊精在食品中的應(yīng)用廣泛：主要用途包括將液體食品轉(zhuǎn)化為固體粉末，以便于包裝、運輸、儲藏和使用；穩(wěn)定食品中的某些成分；消除食品中的異味等［3-5］。除用于環(huán)糊精的生產(chǎn)，還可以利用CGTase的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)對一些食品配料和功能性成分進行酶法改性。比如葡萄糖基-L-抗壞血酸的制備［6］；一些黃酮類化合物，如蘆丁的改性［7］；甜味劑的改良等［8］?？梢援a(chǎn)CGTase的微生物主要是芽孢桿菌屬（Bacillus），包括嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilis）、耐堿性巨大芽孢桿菌（B.megateruim）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、環(huán)化芽孢桿菌（B.circulans）、枯草芽孢桿菌（B.Subtilis）等。除芽孢桿菌外，可以產(chǎn)CGTase的微生物還包括短桿菌（Brevibacterium）、梭菌（Clostridium）、棒桿菌（Corynebacterium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、微 球 菌（Micrococcus）、假 單 胞 菌（Pseudomonas）及曲霉（Aspergillus）等［2，9］。產(chǎn) CGTase菌株篩選，多以生產(chǎn)環(huán)糊精為目的；對于以利用CGTase的轉(zhuǎn)糖基作用對功能性成分進行酶法改性為目的進行菌株篩選的研究則鮮見報道。本實驗利用產(chǎn)CGTase菌株快速篩選法［10］結(jié)合蘆丁轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，從淀粉廠廠區(qū)土壤樣品中篩選獲得一個菌株；此菌株具有較高的轉(zhuǎn)糖基活性。對該菌株進行了形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA鑒定，并對利用該菌株所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化淀粉生成環(huán)糊精以及蘆丁的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣 取自無錫雙佳淀粉廠廠區(qū)；蘆丁 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；乙腈 色譜純，Sigma公司；其他試劑 上海國藥集團；環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase） 用菌株Bacillus licheniformis SK13.002發(fā)酵制得。

DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床 上海杜科自動化設(shè)備有限公司；Eppendorf 5804R低溫高速離心機德國 Eppendorf公司；Millipore超濾設(shè)備 美國Millipore公司；恒溫水浴振蕩器 江蘇金壇市億通電子有限公司；Agilent高效液相色譜儀 Agilent 1200。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)CGTase微生物快速篩選 快速篩選方法參照Park等［10］的報道。篩選平板培養(yǎng)基的組成為：1%可溶性淀粉，0.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.1%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，1%Na2CO3，1.5% 瓊脂，0.03%酚酞和0.01%甲基橙。

1.2.2 菌株形態(tài)、生理生化和16S rRNA分析鑒定菌株形態(tài)、生理生化鑒定利用 Biolog OmniLog Identification System（美國Biolog公司）自動分析完成。16S rRNA基因擴增用引物為通用引物，27F 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1527R 5′-AGAAA GGAGGTGATCCAGCC-3′。分析鑒定由中國典型物保藏中心（CCTCC）完成。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)CGTase 產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基的組成為：1% 可溶性淀粉，1% 大豆蛋白胨，0.5% 酵母膏，0.1%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O 和 0.8%Na2CO3。

1.2.4 蘆丁酶轉(zhuǎn)化方法 蘆丁的酶法轉(zhuǎn)化方法參照Suzuki等的方法［7］，并對酶反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。具體方法如下：0.1g蘆丁溶解在5mL甲醇中，0.5g糊精溶解在5mL 0.2mol/L的醋酸鈉緩沖液中（pH 5.5）。二者均勻混合，混合液中含有10mmol/L CaCl2。加入適量濃縮酶液，置水浴振蕩器中進行酶反應(yīng)。反應(yīng)溫度為35℃，水浴振蕩器的轉(zhuǎn)速為200r/min，酶反應(yīng)持續(xù)進行72h。反應(yīng)液沸水浴滅酶后高速離心，過0.45μm膜后待HPLC測定。

1.2.5 糖基化蘆丁的測定 酶法轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物糖基化蘆丁的測定采用高效液相色譜（HPLC）法。色譜條件如下：色譜柱：Agilent公司 ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.5mm×150mm，5μm）；流動相：V（乙腈）∶V（超純水）∶V（甲酸）=18∶81.9∶0.1；流動相流速：0.8mL/min；進樣量：5μL；紫外檢測波長：254nm；柱溫：30℃。

1.2.6 淀粉轉(zhuǎn)化生成環(huán)糊精 5%（w/v）的可溶性淀粉的 Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH 7.0）中加入適量濃縮酶液，65℃水浴24h。反應(yīng)液沸水浴滅酶，α-淀粉酶處理后高速離心，過0.45μm膜后待HPLC測定。

1.2.7 環(huán)糊精的測定 環(huán)糊精的測定采用HPLC法。色譜條件如下：色譜柱：Asahipak NH2P-50 4E Shodex column（4.6mm id × 250mm，Tokyo，Japan）；流動相：V（乙腈）∶V（超純水）=70∶30；流動相流速：1.0mL/min；進樣量：5μL；示差折光檢測器檢測；柱溫：30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選和鑒定

利用產(chǎn)CGTase菌株快速篩選方法，篩選獲得18個具有較高CGTase酶活的菌株，菌株發(fā)酵液中酶活從2.8U/mL到4.1U/mL不等。利用這些菌株發(fā)酵得到的發(fā)酵液，進行蘆丁的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，通過比較蘆丁的轉(zhuǎn)化率，最終獲得一株菌株，所產(chǎn)酶液可高效轉(zhuǎn)化蘆丁獲得糖基化蘆丁。對此菌株進行形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA鑒定。

生理生化和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果列于表1中。結(jié)果顯示，該菌株為桿狀的革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生芽孢?？衫玫矸郏€原硝酸鹽為亞硝酸鹽等。

表1 菌株生理生化和形態(tài)學(xué)鑒定

16S rRNA鑒定結(jié)果表明，該菌株16S rRNA序列共1472bp，將序列到NCBI進行BLAST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的16S rRNA序列同源性最高，達到了100%。將其16S rRNA序列提交GenBank得到的接受號為GU570959。結(jié)合生理生化和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus licheniformis SK13.002。

B.licheniformis SK13.002發(fā)酵產(chǎn)酶實驗中研究了培養(yǎng)基中Na2CO3濃度和pH對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果顯示（表2），在Na2CO3濃度為0.8%，pH約為10時菌株的產(chǎn)酶量最高，達到了4.12U/mL；此外，在此條件下，菌株的生長狀況良好，顯示其嗜堿性。

表2 培養(yǎng)基Na2CO3濃度和pH對產(chǎn)酶的影響

表3 不同來源CGTase生成環(huán)糊精比較

2.2 環(huán)糊精生產(chǎn)

利用B.licheniformis SK13.002發(fā)酵得到的粗酶液，以5%的可溶性淀粉作為底物生成環(huán)糊精，在沒有經(jīng)過任何優(yōu)化的情況下獲得了50.2%的產(chǎn)率。產(chǎn)物中含有83.3%的β-環(huán)糊精和16.7%的γ-環(huán)糊精；β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的比率為4.99∶1；產(chǎn)物中不含α-環(huán)糊精。酶反應(yīng)產(chǎn)物中β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的含量分別達到20.9g/L和4.2g/L。

在酶反應(yīng)過程中，反應(yīng)產(chǎn)物環(huán)糊精，特別是β-環(huán)糊精在最初的12h快速增加，β-環(huán)糊精達到16.1g/L；在之后的12h則緩慢增加，最終β-環(huán)糊精含量達到20.9g/L，β-環(huán)糊精的比例超過80%，說明該菌株具有實際應(yīng)用于環(huán)糊精生產(chǎn)的潛力。不同來源的CGTase轉(zhuǎn)化淀粉生成環(huán)糊精的種類和比例不同，通常為三種環(huán)糊精的混合物。將本實驗中菌株所產(chǎn)CGTase轉(zhuǎn)化淀粉生成環(huán)糊精同其他來源CGTase生成環(huán)糊精進行比較，結(jié)果列于表3中。

另外，在Hill等［16］的研究報道中，地衣芽孢桿菌以淀粉作為底物生產(chǎn)環(huán)糊精，所產(chǎn)的環(huán)糊精為α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精，產(chǎn)物中沒有γ-環(huán)糊精。本研究同其結(jié)果存在差異，具體原因有待于進一步的研究探討。

2.3 蘆丁糖基化

利用B.licheniformis SK13.002發(fā)酵得到的發(fā)酵液，經(jīng)過超濾濃縮獲得的濃縮發(fā)酵液，直接進行蘆丁的轉(zhuǎn)糖基酶反應(yīng)。經(jīng)過酶反應(yīng)條件的優(yōu)化，蘆丁的轉(zhuǎn)化率（糖基化蘆丁/糖基化蘆丁 +殘余蘆丁 ×100%）得到了提高；在優(yōu)化后的酶反應(yīng)條件下，利用濃縮發(fā)酵液，蘆丁的轉(zhuǎn)化率達到了近70%。蘆丁經(jīng)過糖基化后生成的糖基化蘆?。ㄆ咸烟腔J?。苄蕴岣?×104倍，穩(wěn)定性也得到提高［7］。

酶反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC譜圖參見圖1。圖中蘆丁的保留時間為6.12min，糖基化蘆?。℅1-rutin，G2-rutin，G3-rutin分別表示蘆丁中轉(zhuǎn)入1，2，3個葡萄糖單元）分別為5.73、5.06、4.52min。

圖1 酶反應(yīng)產(chǎn)物HPLC譜圖

3 結(jié)論

從土樣中篩選得到一個產(chǎn)CGTase的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA基因序列分析，鑒定為B.licheniformis，命名為B.licheniformis SK13.002。利用B.licheniformis SK13.002發(fā)酵獲得的酶液，以可溶性淀粉作底物，生成的環(huán)糊精主要為β-環(huán)糊精，另外還有少量的γ-環(huán)糊精，其中β-環(huán)糊精超過80%；環(huán)糊精的產(chǎn)率達到50.2%。濃縮酶液亦可直接用作蘆丁的酶法糖基化，在優(yōu)化后的酶反應(yīng)條件下，蘆丁的轉(zhuǎn)化率達到近70%?？傊?，B.licheniformis SK13.002在蘆丁糖基化和環(huán)糊精生產(chǎn)具有潛在的應(yīng)用價值。

［1］Van der Veen BA，van Alebeek G-JWM，Uitdehaag JCM，et al.The three transglycosylation reactions catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans（strain 251）proceed via different kinetic mechanisms［J］.Eur J Biochem，2000，267：658-665.

［2］Biwer G，Antranikian E，Heinzle.Enzymatic production of cyclodextrins［J］.ApplMicrobiolBiotechnol，2002，59：609-617.

［3］Del Valle E.Cyclodextrins and their uses：a review［J］.Process Biochem，2004，39：1033-1046.

［4］Hedges AR.Industrial Applications of Cyclodextrins［J］.Chem Rev，1998，98：2035-2044.

［5］Singh M，Sharma R，Banerjee UC.Biotechnological applications of cyclodextrins［J］.Biotechnol Adv，2002，20：341-359.

［6］Aga H，Yoneyama M，Sakai S，et al.Synthesis of 2-o-αglucopyranosyl L-ascorbic acid by cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus stearothermophilus［J］.Agric Biol Chem，1991，55：1751-1756.

［7］Suzuki Y，Suzuki K.Enzymatic formation of 4G-α-D-glucopyranosyl-rutin［J］.Agric Biol Chem，1991，55：181-187.［8］Tanaka O.Improvement of taste of natural sweeteners［J］.Pure&Appl Chem，1997，69（4）：675-683.

［9］田輝，楊國武，徐頤玲，等.環(huán)狀糊精與環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶［J］.工業(yè)微生物，1995，25（2）：33-38.

［10］Park CS，Park KH，Kim SH.A rapid screening method for alkaline β-cyclodextrin glucanotransferase using phenolphthalein-methyl orange-containing-solid medium［J］.Agric Biol Chem，1989，53：1167-1169.

［11］Atanasova N，Petrova P，Ivanova V，et al.Isolation of novel alkaliphilic Bacillus strains for cyclodextrin glucanotransferase production［J］.Appl Biochem Biotechnol，2008，149：155-167.

［12］Sian HK，Said M，Hassan O，et al.Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic Bacillus sp.G1［J］.Process Biochemistry，2005，40：1101-1111.

［13］Shin HD，Park HT，Lee YH.Site-directed mutagenesis and functional analysis of maltose-binding site of cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus firmus var.alkalophilus［J］.Biotechnology Letters，2000，22：115-121.

［14］Pishtiyski I，Zhekova，B.Effect of different substrates and their preliminary treatment on cyclodextrin production［J］.World Journal of Microbiology&Biotechnology，2006，22：109-114.

［15］Yim DG，Sato HH，Park YH，et al.Production of cyclodextrin from starch by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus firmus and characterization of purified enzyme［J］.J Industrial Microbiol Biotechnol，1997，18：402-405.

［16］Hill DE，Aldape R，Rozzell JD.Nucleotide sequence of a cyclodextrin glucosyltransferase gene，cgtA，from Bacillus licheniformis［J］.Nucleic Acids Res，1990，18：199-200.

Screening，identification and applications of a cyclodextrin glucanotransferase-producing microbial strain

SUN Tao1，JIANG Bo1，*，PAN Bei-lei2，Letsididi Rebaone1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Chinese Institute of Food Science and Technology，Beijing 100006，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0210-04

2010-05-13 *通訊聯(lián)系人

孫濤（1969-），男，博士研究生，講師，研究方向：食品酶與生物技術(shù)。

江蘇省自然基金創(chuàng)新學(xué)者攀登項目（BK2008003）。