大孔吸附樹脂對鮮味肽分離效果及影響因素的研究

夏克勝，肖如武，趙謀明，崔 春

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641)

大孔吸附樹脂對鮮味肽分離效果及影響因素的研究

夏克勝，肖如武，趙謀明*，崔 春

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641)

從6種極性不同的大孔吸附樹脂(NKA－Ⅱ，D3520，X－5，D101，AB－8，DA201)中篩選出一種對鮮味肽吸附性能強(qiáng)、解吸率高、產(chǎn)品鮮味佳的大孔吸附樹脂NKA－Ⅱ。研究了粗肽液濃度、乙醇濃度、吸附時間等條件對大孔吸附樹脂的吸附性能和解吸率的變化規(guī)律，并采用先靜態(tài)吸附再動態(tài)解吸分離得到鮮味肽。通過感官評價，分析了鮮味肽呈味閾值和鮮味肽與其它鮮味劑的協(xié)同效應(yīng)。研究結(jié)果表明，NKA－Ⅱ樹脂為快速平衡型樹脂，粗肽液濃度為20mg/mL，吸附效果最佳，洗脫劑乙醇濃度為75%，解吸率最高。鮮味肽呈味閾值為0.125mg/mL，鮮味肽與谷氨酸鈉MSG的協(xié)同效果最顯著，增效系數(shù)為14.3%。

大孔吸附樹脂，鮮味肽，分離純化，感官評價

Abstract:The adsorption capacity and the desorption rate of six kinds of domestic macroporous resins(NKA－Ⅱ，D3520，X－5，D101，AB－8，DA201)for umami peptide was investigated.The NKA－Ⅱ type macroporous resin had the optimum adsorption property.It was shown that the adsorption capacity and the desorption rate was influenced by the concentration of umami peptide and ethanol，reaction time ect.Umami peptide purified by macroporous resin static adsorption－dynamic desorption.The result was found that the NKA－Ⅱ type macroporous resin was quick balanced resin.It had the best separating efficiency when the umami peptide content in the liquid was 20mg/mL equivalent to raw material and the concentration of ethanol was 75%.Its threshold value was 0.125mg/mL and the MSG had the better synergic effect with umami peptide than others through the sensory evaluation and the synergistic coefficients was 14.3%.

Key words:macroporous resin;umami peptide;purify;sensory evaluation

近年來，肽呈味功能的理論和應(yīng)用引起了各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。1978年，Yamasaki分離純化得到氨基酸序列為 Lys－Gly－Asp－Glu－Glu－Ser－Leu－Ala的美味提升肽(savory taste－ enhancing peptide)［1－2］。1996年，Spanier等發(fā)現(xiàn)合成的美味肽較MSG有更強(qiáng)的風(fēng)味感覺與口感［3］。2002年，Hediwg等在面筋蛋白酶解液中，分離純化得到四種具有鮮味的二肽和三肽［4］。日、韓在鮮味肽的性質(zhì)、應(yīng)用規(guī)律方面居世界領(lǐng)先地位，而我國在鮮味肽基礎(chǔ)理論以及應(yīng)用研究方面比較薄弱。藍(lán)蛤是大宗低值蛋白資源之一，其蛋白酶解液具有強(qiáng)烈濃郁的鮮味，是生產(chǎn)富含呈味肽的海鮮調(diào)味料的優(yōu)質(zhì)原料。蛋白質(zhì)酶解液的成分復(fù)雜多樣，因此分離富集酶解液中呈味肽成為研究和生產(chǎn)海鮮調(diào)味料中呈味肽的技術(shù)關(guān)鍵。目前使用金屬離子沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法制得的活性多肽和蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度不高，而大孔樹脂具有比表面積大、吸附和解吸容量大、選擇性好、吸附和解吸速度快、吸附條件溫和、再生處理方便等優(yōu)點(diǎn)，同時經(jīng)大孔吸附法可得到純度和功效較高的活性多肽和蛋白質(zhì)產(chǎn)品［5］。因此本文采用大孔吸附樹脂對鮮味肽分離純化并對樣品進(jìn)行感官分析，為后續(xù)蛋白利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗肽液;大孔吸附樹脂 見表1，天津市海光化工有限公司;DH132 Folin－酚蛋白定量試劑盒 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Protamex(測定活力1.0×104U/g)、Flavorzyme500MG(測定活力 3.0 ×104U/g) 諾維信公司;其他試劑 均為分析純。

THZ－82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;UV－2100型分光光度計 Unico(上海)儀器有限公司;玻璃層析柱2.6cm×40cm 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;ALPHA 1－4 LDplus冷凍干燥機(jī) Christ公司;KDN－2C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;GL－21M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

表1 大孔吸附樹脂指標(biāo)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗肽液的制取 酶解條件采用前期響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取解凍后藍(lán)蛤肉糜，以料液比1∶2加去離子水勻漿1min，在溫度為53±2℃，采用雙酶復(fù)合水解，加酶量為 Protamex 3.0×104U/kg藍(lán)蛤肉和Flavorzyme500MG 9.0×104U/kg藍(lán)蛤肉，恒溫攪拌水解6h。酶解完畢，將酶解液于沸水浴中滅酶15min，離心(6000×g，15min)，102定性濾紙過濾，然后依次通過截留分子量(MWCO)為10000Da的超濾膜和3000Da的超濾膜二級超濾，透過液即為粗肽液。

1.2.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 大孔吸附樹脂用無水乙醇充分浸泡24h，用去離子水沖洗取代乙醇，直至上清液于240nm下無吸收峰，濾去水分備用。

1.2.3 大孔吸附樹脂篩選

1.2.3.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附率測定 取8.5g預(yù)先處理好的6種不同大孔吸附樹脂，加入1mg/mL粗肽液150mL，于25℃水浴恒溫振蕩器中振蕩12h(振蕩速度200次/min)，真空抽濾，測定濾液中肽含量，按下式計算［6］:

吸附率=(原液蛋白濃度－吸附液蛋白濃度)/原液蛋白濃度×100%

吸附量=(原液蛋白濃度－吸附液蛋白濃度)×溶液體積/干樹脂重量

1.2.3.2 大孔吸附樹脂靜態(tài)解吸率測定 8.5g上述已吸附完全大孔樹脂加入濃度為70%乙醇150mL，解吸，按下式計算:

解吸率=解吸液蛋白濃度×解吸液體積/(原液蛋白濃度－吸附液蛋白濃度)×吸附液體積×100%

1.2.4 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附曲線 稱取5g NKA－Ⅱ，加入80mL濃度為1mg/mL和2mg/mL粗肽液，在固定時間點(diǎn)取樣并檢測溶液中肽含量。

1.2.5 大孔吸附樹脂靜態(tài)解吸曲線 將上述吸附完全樹脂加入80mL 75%乙醇溶液中，在固定時間點(diǎn)取樣并檢測溶液中肽含量。

1.2.6 底物濃度的確定 稱取5g NKA－Ⅱ，分別加入不同濃度粗肽液 80mL(mg/mL):1、2、4、10、20、37。吸附結(jié)束測定濾液中的肽含量。

1.2.7 解吸液乙醇濃度的確定 5g吸附完全樹脂，分別加入不同乙醇濃度解吸液80mL(%):0、25、50、75、100。解吸結(jié)束測定濾液中的肽含量。

1.2.8 鮮味肽分離制備 600g濃度為20mg/mL粗肽液，加入130g濕樹脂，充分吸附，濕法裝柱，依次用乙醇濃度(%):5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 各洗脫 200mL。每4個不同濃度洗脫液合并成一個組分，將5%～20%乙醇濃度洗脫液混合為組分A，依次得到B、C、D、E 4個組分的洗脫液，凍干保藏。

1.2.9 感官評價 以0.6mg/mL MSG水溶液為參照底物，采用 TDA(taste dilution analysis)法［7］確定鮮味肽的呈味閾值。

以牛肉湯(水∶牛肉∶鹽 =100∶10∶1)為底物，煮制20min后即可［8］，各組分鮮味肽添加濃度為0.2mg/mL牛肉湯，篩選風(fēng)味最佳組分。

底物為 10mg/mL NaCl水溶液，并以味精(MSG)、肌苷酸+鳥苷酸(I+G)為協(xié)同參照物，評價鮮味肽與MSG、I+G的協(xié)同效應(yīng)，對鮮味肽及其與MSG、I+G的協(xié)同鮮味呈味作用進(jìn)行感官評價［9］。感官評定小組由10人組成，評定員用蒸餾水漱口之后，取待評定液1～2mL置于口中，10s后吐出，漱口后取標(biāo)準(zhǔn)液品嘗，濃度依次評定鮮味從弱到強(qiáng)打分制，分值為0～10，結(jié)果取10人評定值的平均值。

1.2.10 成分分析 蛋白測定見文獻(xiàn)［10］;水分測定見文獻(xiàn)［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

6種樹脂對粗肽液的吸附能力和解吸率結(jié)果如表2所示，極性樹脂NKA－Ⅱ、DA201吸附能力較其它樹脂強(qiáng)，同時，NKA－Ⅱ的解吸率明顯高于DA201，且NKA－Ⅱ解吸液鮮味分值較高。樹脂的極性以及孔容徑都會影響樹脂吸附率和吸附量，因?yàn)榭兹輳降拇笮≈苯佑绊憳渲捏w積比表面積，孔容徑增大會引起體積比表面積下降，會使吸附量下降［11］。故孔容徑小的NKA－Ⅱ樹脂吸附效果最佳。極性樹脂對粗肽液吸附效果佳，可初步判斷粗肽液中貢獻(xiàn)鮮味的成分具有較強(qiáng)極性。綜合考慮樹脂吸附效果和解吸液鮮味貢獻(xiàn)，選擇NKA－Ⅱ?yàn)橹饕芯繕渲?/p>

表2 六種樹脂吸附解吸效果比較

2.2 靜態(tài)吸附曲線

NKA－Ⅱ大孔吸附樹脂對粗肽液的吸附率隨吸附時間的變化規(guī)律如圖1所示，在吸附開始階段吸附率快速上升，尤其是在開始吸附前0.5h內(nèi)，吸附率上升速度最快，0.5～4h內(nèi)緩慢上升，4～7h階段吸附率基本保持不變，7h后吸附率開始略微下降。大孔吸附樹脂對化合物的吸附作用主要是基于化合物的疏水基團(tuán)與非極性吸附劑之間的范德華力或親水基團(tuán)與極性吸附劑之間的氫鍵，同時也通過本身的多孔網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)對分子大小不同的化合物加以篩選［12］。因此樹脂能迅速吸附粗肽液，但長時間吸附過程中，部分已經(jīng)吸附的化合物由于其親水基團(tuán)的作用，會再次解吸到水溶液中，使后期吸附率稍有下降。

圖1 吸附率隨時間的變化規(guī)律

2.3 靜態(tài)解吸曲線

上述已吸附鮮味肽的NKA－Ⅱ大孔吸附樹脂解吸率隨時間的變化規(guī)律如圖2所示，圖中1、2分別表示已完全吸附1、2mg/mL粗肽液的NKA－Ⅱ解吸曲線。在解吸過程開始階段就迅速達(dá)到較高的解吸率，解吸時間為1h時，解吸率分別達(dá)到83.39%和62.83%，整個解吸過程中，解吸率最大值分別為95.45%和65.48%。

圖2 解吸率隨時間的變化規(guī)律

2.4 底物濃度對吸附效果的影響

NKA－Ⅱ大孔吸附樹脂對鮮味肽的吸附率和吸附量隨底物濃度的變化規(guī)律如圖3所示，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?20mg/mL時，吸附率為 59.07%，吸附量為198.82mg/g，而當(dāng)?shù)孜餄舛葹?7mg/mL時，吸附率和吸附量分別為48.30%和299.22mg/g。吸附率隨濃度的增加而增加，在20mg/mL時達(dá)到最高值，而吸附量則隨著濃度的增加逐漸增加，在20～37mg/mL過程增速也較前面低濃度時變緩。當(dāng)NKA－Ⅱ大孔吸附樹脂已基本完全吸附，繼續(xù)增加底物濃度，吸附則下降，吸附量增加幅度也降低。考慮合理有效利用粗肽液，實(shí)驗(yàn)選取20mg/mL的底物濃度為后續(xù)研究對象。

2.5 乙醇濃度對解吸效果的影響

不同濃度乙醇對已吸附鮮味肽的NKA－Ⅱ大孔吸附樹脂解吸效果影響如圖4所示。解吸效果與解吸液的極性具有顯著相關(guān)性。通常情況下洗脫劑極性越小，其洗脫能力越強(qiáng)。水的解吸率只有12.58%，隨乙醇濃度增加解吸率增加，在乙醇濃度從0%增加至25%時，解吸率由12.58%達(dá)到79.98%，增速最快，當(dāng)乙醇濃度在75%時解吸率達(dá)到最大值92.14%，無水乙醇的解吸率為70.59%有所下降，分析可能是鮮味肽在無水乙醇里溶解度下降。

圖3 粗肽液濃度對吸附效果的影響

圖4 乙醇濃度對解吸率的影響

2.6 鮮味肽的分離制備

洗脫過程中，流動相濃度變化過大時，會產(chǎn)生氣泡影響實(shí)驗(yàn)效果，故本實(shí)驗(yàn)乙醇濃度緩慢增加，減少氣泡產(chǎn)生。由圖5發(fā)現(xiàn)，組分A洗脫液中，鮮味肽含量最高，隨著吸附的鮮味肽逐漸被洗脫，高濃度的乙醇洗脫液中鮮味肽含量逐漸減少。

圖5 乙醇濃度對鮮味肽含量的影響

2.7 感官評價

2.7.1 鮮味肽呈味閾值和組分篩選 MSG的閾值為0.3mg/mL，本實(shí)驗(yàn)選取2倍閾值濃度MSG水溶液為參照樣，由圖6可知，1mg/mL鮮味肽的 TD(Taste Dilution)值為8，而0.6mg/mL MSG的 TD為2，可以得到鮮味肽的呈味閾值為0.125mg/mL。

由表3發(fā)現(xiàn)鮮味肽均具有鮮味提升效果，組分B和組分E分離得到的鮮味肽對鮮味提升效果更加明顯。分析鮮味肽具有鮮味感官是其分子中帶正電基團(tuán)、帶負(fù)電基團(tuán)和疏水性基團(tuán)之間的相互作用，其中疏水性基團(tuán)起助鮮作用［13］。在解吸液極性較高(乙醇濃度較低)時，組分中主要以帶電基團(tuán)提升鮮味，隨著解吸液極性逐漸降低，疏水性增大，助鮮作用增強(qiáng)［14］。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，添加鮮味肽的組分都有顯著加強(qiáng)了的口感厚實(shí)感。

圖6 鮮味肽的TDA值

表3 不同組分洗脫液對鮮味提升效果的影響

表4 鮮味肽與其它鮮味劑的協(xié)同效應(yīng)

2.7.2 鮮味肽與鮮味劑的協(xié)同效應(yīng) 由表4得到，組分B與MSG具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，增效系數(shù)為14.3%，而組分B與I+G基本協(xié)同效應(yīng)不明顯。MSG、組分B、I+G不同比例配比對鮮味提升效果有顯著差異，尤其MSG添加量改變，對鮮味的增效影響最大。

3 結(jié)論

藍(lán)蛤粗肽液經(jīng)過NKA－Ⅱ大孔吸附樹脂處理后，目標(biāo)鮮味肽段得到有效富集，發(fā)現(xiàn)分離得到的鮮味肽對鮮味具有顯著提升效果，在弱極性溶劑中呈現(xiàn)較強(qiáng)的鮮味和濃厚味。同時本實(shí)驗(yàn)分離得到的鮮味肽與味精協(xié)同效應(yīng)明顯，對風(fēng)味的厚實(shí)感也有提升效果。

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Study on domestic macroporous resins for purifying umami peptide

XIA Ke－sheng，XIAO Ru－wu，ZHAO Mou－ming*，CUI Chun
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China)

TS201.2+1

A

1002－0306(2010)08－0144－04

2009－12－15 *通訊聯(lián)系人

夏克勝(1987－)，男，碩士，研究方向:食品生物技術(shù)。