海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素的生物合成

孔 青，劉奇正，耿 娟，王秀丹，于方塘

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003;2.山東省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島266005)

海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素的生物合成

孔 青1，劉奇正1，耿 娟2，王秀丹1，于方塘1

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003;2.山東省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島266005)

從海洋中分離篩選出一株巨大芽孢桿菌，在PDA平板上此株巨大芽孢桿菌可以顯著抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，進(jìn)而重點(diǎn)研究其對(duì)黃曲霉毒素合成的影響。結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)基中此株海洋巨大芽孢桿菌極顯著地抑制黃曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素(p＜0.01);另外研究發(fā)現(xiàn)，在受機(jī)械損傷的花生上，此株巨大芽孢桿菌也可顯著抑制黃曲霉毒素的生物合成(p＜0.05);而在沒有機(jī)械損傷的花生上，此株芽孢桿菌沒能表現(xiàn)出抑制毒素合成的能力。抑制機(jī)理初步認(rèn)為，該株海洋巨大芽孢桿菌通過競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)和產(chǎn)生某種次級(jí)代謝產(chǎn)物，抑制黃曲霉的生長(zhǎng)和黃曲霉毒素合成基因的表達(dá)。

巨大芽孢桿菌，抑制，黃曲霉，黃曲霉毒素

Abstract:A strain of marine Bacillus megaterium was screened from the ocean.This strain of B.megaterium exhibited high inhibitory effect on the growth of Aspergillus flavus on PDA plates，so the inhibitory effect on the biosynthesis of aflatoxin was further studied.The results showed this strain of B.megaterium could significantly inhibit the biosynthesis of aflatoxin both in liquid medium(p＜0.01)and mechanical damaged peanuts(p＜0.05)，but didn’t exhibit inhibitory biosynthesis effect in intact peanuts.The primary inhibitory mechanisms were accredited to competitive growth and some kinds of metabolites secreted by this strain of B.megaterium which could inhibit the growth of A.flavus and expression of the genes relating to aflatoxin biosynthesis.

Key words:Bacillus megaterium;inhibition;Aspergillus flavus;aflatoxin

黃曲霉毒素是一大群結(jié)構(gòu)十分相似的曲霉的次生代謝產(chǎn)物，包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素 M1(AFM1)、黃曲霉毒素 M2(AFM2)等18種之多，目前已證實(shí)能產(chǎn)生黃曲霉毒素(aflatoxin)的菌株主要是曲霉屬的黃曲霉(Aspergillus flavus Link)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus Speare)［1］。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，黃曲霉毒素可使人類和多種動(dòng)物誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性肝癌，是目前已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物。我國是世界上最大的花生出口國，出口量占國際出口總量的三分之一，但是黃曲霉毒素是當(dāng)前花生等糧食作物出口面臨的最大技術(shù)性難題，也是2006年以來我國花生出口量持續(xù)下降的主要原因。所以，篩選出既可以抑制黃曲霉生長(zhǎng)和毒素合成，又不會(huì)對(duì)花生等糧食作物產(chǎn)生二次污染，即安全無毒的抗黃曲霉微生物或功能因子，具有很大的開發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值。近幾年，隨著海洋生物技術(shù)的發(fā)展，從海洋生物中提取的抗菌活性物質(zhì)層出不窮。覆蓋地球表面積71%的海洋是生命的發(fā)源地，其生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過陸地;另外，海洋環(huán)境具有與陸地環(huán)境顯著不同的特征，如高壓、低營養(yǎng)、低溫、無光照以及局部高溫、高鹽等所謂的生命極限環(huán)境，海洋微生物適應(yīng)了海洋獨(dú)特的生活環(huán)境，必然造就其獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景，生物學(xué)特性有別于陸地微生物，具有產(chǎn)生抑制黃曲霉毒素生物合成的活性物質(zhì)的巨大潛力［2－4］。目前，實(shí)驗(yàn)室已從黃海中分離篩選出一株抑制黃曲霉活性高的微生物，利用16S rDNA特異性擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)對(duì)其菌種鑒定，結(jié)果表明這是一株海洋巨大芽孢桿菌。進(jìn)而研究此株海洋巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉菌絲延長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用，本文將重點(diǎn)研究此株巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素生物合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洋巨大芽孢桿菌 分離自黃海，保存于中國海洋大學(xué)食品學(xué)院生物工藝實(shí)驗(yàn)室，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng);黃曲霉(Aspergillus flavus Link)山東省花生研究所單世華研究員提供，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA)培養(yǎng);花生 市售，大小、成熟度均勻一致，無腐爛;Beacon黃曲霉毒素檢測(cè)試劑盒 美國Beacon公司。

恒溫振蕩箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司;3－18R型高速冷凍離心機(jī) 美國TOMOS公司;Multiskan MK3型酶標(biāo)儀

美國THEROM FISHER公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;QHX－300BS－Ⅲ人工氣候箱 上海新苗醫(yī)療器械廠;高溫蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 黃曲霉毒素的定量測(cè)定

采用Beacon黃曲霉毒素檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)于液體中黃曲霉毒素的測(cè)定，每次測(cè)定直接取50μL液體按黃曲霉毒素檢測(cè)試劑盒說明書操作。

對(duì)于花生中黃曲霉毒素的測(cè)定，測(cè)定前需要做如下預(yù)處理:a.粉碎花生，然后過20目篩;b.準(zhǔn)確稱5g粉碎的花生放入100mL蒸餾水中;c.劇烈振蕩3min;d.靜置 2～3min，使花生沉淀;e.用濾紙(Whatman GF/A)過濾，用干凈的容器收集，濾液按黃曲霉毒素檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定黃曲霉毒素含量。

1.3 抑制黃曲霉的生長(zhǎng)

用無菌打孔器打直徑6mm的長(zhǎng)有黃曲霉的瓊脂塊倒置于PDA培養(yǎng)基平板中央，將兩片直徑6mm的無菌濾紙片分別放于距PDA平板中心2.5cm處。實(shí)驗(yàn)組在每張濾紙片上分別滴加8μL的巨大芽孢桿菌培養(yǎng)液(108CFU/mL)，對(duì)照組在濾紙片上滴加8μL無菌水，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各重復(fù)五個(gè)PDA平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6d［5］。

1.4 抑制黃曲霉毒素的生物合成

106個(gè)/mL的黃曲霉孢子與108個(gè)/mL的海洋巨大芽孢桿菌混合培養(yǎng)于 PDA液體培養(yǎng)基中(含106個(gè)/mL的黃曲霉孢子的PDA液體培養(yǎng)基為對(duì)照)，28℃下?lián)u床培養(yǎng)7d，每天用Beacon黃曲霉毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)黃曲霉毒素含量。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 抑制黃曲霉毒素在花生上的生物合成

取80個(gè)花生，在0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒1min，自來水沖洗干凈，自然風(fēng)干后分成A(不打孔孢子)、B(不打孔混菌)、C(打孔孢子)、D(打孔混菌)四組，每組20個(gè)花生。C、D組的花生用無菌打孔器打出直徑6mm，深約3mm的小孔。將A、C組的花生浸泡在黃曲霉孢子(106個(gè)/mL)溶液中侵染1min;將B、D組的花生浸泡在海洋巨大芽孢桿菌(108CFU/mL)和黃曲霉孢子(106個(gè)/mL)的混合液中侵染1min。將侵染后的A、B、C、D四組花生分別放入人工氣候箱，控制溫度28℃、相對(duì)濕度90%，培養(yǎng)7d后用Beacon黃曲霉毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組花生中的黃曲霉毒素含量。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制黃曲霉的生長(zhǎng)

海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉生長(zhǎng)的結(jié)果見圖1，濾紙片周圍有白色芽孢桿菌菌落，黃曲霉生長(zhǎng)受到明顯抑制(平板兩側(cè)的菌體是巨大芽孢桿菌;中間黃綠色的是黃曲霉);而對(duì)照組中黃曲霉長(zhǎng)勢(shì)良好，菌落布滿整個(gè)平板。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海洋巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

圖1 巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉的生長(zhǎng)

2.2 抑制黃曲霉毒素的生物合成

海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素合成的結(jié)果見圖2，由圖2可知，在第0d，液體培養(yǎng)基中的黃曲霉毒素含量在7ppb左右;但在培養(yǎng)的第1d，對(duì)照組(黃曲霉孢子)中的黃曲霉毒素含量迅速上升到101.07±4.16ppb，實(shí)驗(yàn)組(黃曲霉孢子和巨大芽孢桿菌)中的黃曲霉毒素含量上升到40.64±8.76ppb，巨大芽孢桿菌顯著抑制了黃曲霉毒素在PDA液體培養(yǎng)基中的合成(p＜0.01);在培養(yǎng)的第2d，對(duì)照組中的黃曲霉毒素含量上升到112.36±5.17ppb，此后隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，黃曲霉毒素含量并沒有增加而保持相對(duì)穩(wěn)定，說明此株黃曲霉主要在培養(yǎng)的前兩天產(chǎn)生黃曲霉毒素(液體培養(yǎng)基中);實(shí)驗(yàn)組中的黃曲霉毒素含量從培養(yǎng)的第2d開始有所下降，在培養(yǎng)的第3d下降至14.66±1.52ppb，此后隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加保持相對(duì)穩(wěn)定，于是推測(cè)，此株海洋巨大芽孢桿菌不僅能顯著抑制黃曲霉毒素的生物合成，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，也可以降解或破壞一定量的黃曲霉毒素，所以具有很好的應(yīng)用潛力。

圖2 巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素的合成

2.3 抑制黃曲霉毒素在花生上的生物合成

由表1可以看出，A組和B組花生中的黃曲霉毒素含量沒有顯著差異，說明對(duì)于沒有機(jī)械損傷的花生，花生本身具有一定抵御黃曲霉侵染的能力，海洋巨大芽孢桿菌沒有表現(xiàn)出抑制黃曲霉毒素合成的能力;D組花生中的黃曲霉毒素含量顯著低于C組花生中的黃曲霉毒素含量(p＜0.05)，說明對(duì)于有機(jī)械損傷的花生，花生本身將失去部分抵御黃曲霉侵染的能力，使得黃曲霉毒素含量顯著上升(p＜0.05，與A組比較)，而此時(shí)海洋巨大芽孢桿菌表現(xiàn)出了抑制黃曲霉毒素在花生上生物合成的能力;C組花生中的黃曲霉毒素含量顯著高于A組花生中的黃曲霉毒素含量(p＜0.05)，也說明了機(jī)械損傷使花生抵御黃曲霉侵染的能力下降;而D組花生中的黃曲霉毒素含量低于B組花生中的黃曲霉毒素含量，推測(cè)花生受到機(jī)械損傷后，反而有利于巨大芽孢桿菌依附在花生上，從而抑制黃曲霉毒素的生物合成。

3 結(jié)論

在海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中(圖1)發(fā)現(xiàn)，該株巨大芽孢桿菌可顯著抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，初步認(rèn)為該株海洋巨大芽孢桿菌是通過競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)和產(chǎn)生某種次級(jí)代謝產(chǎn)物來抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)［6－7］。

在抑制黃曲霉毒素合成實(shí)驗(yàn)中(圖2)，可以看出此株海洋巨大芽孢桿菌極顯著地抑制黃曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素(p＜0.01);另外研究發(fā)現(xiàn)，在受機(jī)械損傷的花生上，此株巨大芽孢桿菌也可顯著抑制黃曲霉毒素的生物合成;而在沒有機(jī)械損傷的花生上，沒能表現(xiàn)出抑制毒素合成的能力(表1)。抑制機(jī)理初步認(rèn)為是該株海洋巨大芽孢桿菌會(huì)抑制黃曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)基因和黃曲霉毒素合成基因的表達(dá)，如LaeA、aflR、aflS 等［7－8］。本項(xiàng)目小組將繼續(xù)深入研究該株海洋巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素生物合成調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響，以更準(zhǔn)確全面地闡明該株海洋巨大芽孢桿菌對(duì)黃曲霉毒素合成影響的本質(zhì)。

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Inhibitory effect on the aflatoxin biosynthesis by a strain of marine Bacillus megaterium

KONG Qing1，LIU Qi－zheng1，GENG Juan2，WANG Xiu－dan1，YU Fang－tang1
(1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China;2.Inspection and Quarantine Technical Center of Shandong Exit＆ Entry Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266005，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0132－03

2009－08－31

孔青(1979－)，男，博士，講師，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品安全。

青島市科技發(fā)展計(jì)劃(081324jch);國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(081042309)。