脈沖輻解研究橙皮苷、柚皮苷抗氧化活性及機(jī)理探討

鮑小丹，許 晨，黃 娟，馬建華，*

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門(mén)361021;2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門(mén)361021)

脈沖輻解研究橙皮苷、柚皮苷抗氧化活性及機(jī)理探討

鮑小丹1，許 晨2，黃 娟1，馬建華1，*

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門(mén)361021;2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建廈門(mén)361021)

利用脈沖輻解瞬態(tài)吸收光譜技術(shù)研究了橙皮苷和柚皮苷與羥基自由基(·OH)的瞬態(tài)反應(yīng)機(jī)理和動(dòng)力學(xué)。研究結(jié)果表明:N2O飽和的4.9×10－5mol·L－1的橙皮苷、5.2×10－5mol·L－1的柚皮苷水溶液經(jīng)脈沖輻解分別產(chǎn)生了橙皮苷酚氧自由基(特征瞬態(tài)吸收峰320nm)和柚皮苷酚氧自由基(特征瞬態(tài)吸收峰310～340nm);反應(yīng)的表觀反應(yīng)速率常數(shù)分別為8.38×105s－1和6.48×105s－1。橙皮苷和柚皮苷可有效清除羥基自由基。實(shí)驗(yàn)還從結(jié)構(gòu)上探討了橙皮苷和柚皮苷的抗氧化活性機(jī)制。

橙皮苷，柚皮苷，脈沖輻解，作用機(jī)理

Abstract:Respective transient reactions of hesperidin and naringin with hydroxyl radicals and kinetics were investigated by pulse radiolysis.Results showed that N2O－saturated aqueous solution of hesperidin(4.9 ×10－5mol·L－1)and naringin(5.2 × 10－5mol· L－1)generated the phenoxy radical after the pulse radiolysis.The respective transient absorption peak of hesperidin and naringin were at 320nm and 310～340nm.The apparent reaction rate constants of hesperidin and naringin were 8.38 ×105s－1and 6.48 ×105s－1，respectively.Hesperidin and naringin had significant hydroxyl radicals scavenging effect.The probable mechanisms of antioxidants activity in structual aspects were also discussed.

Key words:hesperidin;naringin;pulse radiolysis;mechanism of antioxidation

生物體內(nèi)過(guò)多的羥基自由基(半衰期為10－9s)是引起DNA氧化損傷、生物變異和組織癌變的主要原因之一［1］。因?yàn)樗茉斐蒁NA空間構(gòu)象的改變、DNA單雙鏈的斷裂損傷、DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNADNA交聯(lián)等反應(yīng)，單鏈斷裂中約10%是由羥基自由基引起的［2］。探尋能夠有效清除羥基自由基的天然活性物質(zhì)一直是生物醫(yī)學(xué)、輻射生物學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。橙皮苷和柚皮苷屬二氫黃酮類化合物(Flavanones)，廣泛存在于柑橘類水果中［3－4］(其分子式見(jiàn)圖1)，具有良好的藥學(xué)性質(zhì)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括抗炎、抗癌、抗?jié)?、防止骨質(zhì)疏松、減少血清和肝臟中類脂含量等生物功效［4－7］。但有關(guān)其生物功能的分子作用機(jī)制方面的研究目前報(bào)道不多，尤其利用時(shí)間分辨脈沖輻解技術(shù)研究橙皮苷和柚皮苷清除羥基自由基的性能、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用脈沖輻解瞬態(tài)吸收光譜技術(shù)，研究了橙皮苷和柚皮苷清除羥基自由基的反應(yīng)活性及其動(dòng)力學(xué)特征，并從結(jié)構(gòu)上探討了它們的抗氧化活性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙皮苷和柚皮苷 由國(guó)家海洋局第三海洋研究所提供;過(guò)硫酸鉀(K2S2O8) 天津市福晨化學(xué)試劑廠，化學(xué)純，重結(jié)晶提純后使用;NaOH 上?；瘜W(xué)試劑總廠，分析純;特丁醇 武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，分析純，所有溶液都用三重蒸餾水新鮮配制;N2、N2O 均為含量大于99.99%的高純氣體。

圖1 橙皮苷和柚皮苷結(jié)構(gòu)式

脈沖輻解所用的電子加速器 為中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所10MeV電子直線加速器，電子脈沖寬度為8～10ns可調(diào)，單脈沖劑量為10～40Gy可調(diào)，脈沖電流為 2～3A，以空氣飽和的 0.01mol·L－1KSCN水溶液作為化學(xué)劑量計(jì)，取 ε［(SCN)·］(480nm)=7600dm3·mol－1·cm－1;時(shí)間分辨吸收光譜系統(tǒng)采用500W氙燈為分析光源，分析光以垂直于電子束的方向通過(guò)20mm石英樣品池，經(jīng)44W的單色儀分光，經(jīng)IP28光電倍增管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，電信號(hào)由HP54510B 300Hz瞬態(tài)記錄儀經(jīng)過(guò)A/D數(shù)字示波器轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，并記錄儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)內(nèi)，以自編軟件進(jìn)行動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理［8－9］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橙皮苷和柚皮苷水溶液的脈沖輻解實(shí)驗(yàn) 配制濃度為4.9×10－5mol·L－1的橙皮苷水溶液和5.2×10－5mol·L－1的柚皮苷水溶液，通 N2O 氣體飽和20min后，分別進(jìn)行脈沖輻解實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 橙皮苷和柚皮苷酚氧自由基的確認(rèn) 配制含3.92 × 10－5mol·L－1的橙皮苷、2 × 10－2mol·L－1的K2S2O8及 2 × 10－2mol·L－1的特丁醇，用 N2飽和20min，進(jìn)行脈沖輻解實(shí)驗(yàn)。

配制含 4.16 ×10－5mol·L－1的柚皮苷、2 × 10－2mol·L－1的 K2S2O8及 2 ×10－2mol·L－1的特丁醇，用N2飽和20min，進(jìn)行脈沖輻解實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 羥基自由基的產(chǎn)生［10］

由自由基的化學(xué)輻射產(chǎn)率可知，產(chǎn)生的H·和H2O2的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于·OH的數(shù)量。所以，在研究的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，由光學(xué)儀器所觀察到的信號(hào)主要是由·OH和反應(yīng)物反應(yīng)所引起的。

2.2 橙皮苷和柚皮苷水溶液的脈沖輻解

黃酮類物質(zhì)能和脈沖輻解產(chǎn)生的羥基自由基快速反應(yīng)，因?yàn)榱u基自由基和芳香化合物有很高的反應(yīng)活性。它們主要攻擊黃酮類化合物的酚羥基，生成酚氧自由基［11］。由圖2所示，由N2O飽和的橙皮苷水溶液經(jīng)脈沖輻解得到的在320nm處的吸收帶應(yīng)歸屬為橙皮苷酚羥基與羥自由基反應(yīng)生成的酚氧自由基。由于柚皮苷在310～340nm之間的生成衰減曲線幾乎重合，所以斷定310～340nm處的吸收峰為柚皮苷酚羥基與羥自由基反應(yīng)生成的酚氧自由基。因?yàn)锳環(huán)與不成對(duì)電子無(wú)效的聯(lián)結(jié)，導(dǎo)致橙皮苷和柚皮苷自由基中5－OH的去質(zhì)子化對(duì)自由基的吸收光譜沒(méi)有影響［12］。

圖2 N2O飽和的橙皮苷和柚皮苷水溶液分別脈沖輻解5μs和3μs后獲得的瞬態(tài)吸收光譜圖

圖3和圖4分別是橙皮苷和柚皮苷在各個(gè)吸收峰的衰減動(dòng)力學(xué)曲線。橙皮苷在320nm和400nm處的動(dòng)力學(xué)衰減曲線不相同，這表明至少有2個(gè)瞬態(tài)產(chǎn)物同時(shí)生成，柚皮苷也是一樣。通過(guò)對(duì)比文獻(xiàn)［13］還可以看出，橙皮苷與·OH反應(yīng)在320nm處生成了hesperidin－3’－O·。400nm 處的吸收在5μs內(nèi)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后稍稍衰減，最后在可測(cè)定的時(shí)間段里基本維持不變，由此可以推測(cè)該瞬態(tài)產(chǎn)物可能是一長(zhǎng)壽命的［hesperidin－OH］·中間體。這樣，橙皮苷與·OH反應(yīng)式可推測(cè)為:

hesperidin+·OH→［hesperidin－OH］· +Hesperidin－3’－O·

同理，柚皮苷與·OH反應(yīng)式可推測(cè)為:

naringin+·OH→［naringin－OH］· +Naringin－4’－O·

橙皮苷和柚皮苷對(duì)羥基自由基清除作用的表觀反應(yīng)速率常數(shù)可根據(jù)酚氧自由基的生成曲線(圖3和圖4)分別進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)擬合處理而獲得。由于羥基自由基的濃度遠(yuǎn)低于橙皮苷和柚皮苷的濃度，因而可按準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)求得表觀反應(yīng)速率常數(shù)。橙皮苷和柚皮苷與羥基自由基反應(yīng)的表觀速率常數(shù)分別為8.38 ×105s－1和6.48 ×105s－1。

2.3 橙皮苷和柚皮苷酚氧自由基的確認(rèn)

從圖5中可以看出，該反應(yīng)體系脈沖輻解1μs時(shí)在480nm處出現(xiàn)了一強(qiáng)吸收峰，并迅速衰減，其特征與文獻(xiàn)報(bào)道的硫酸根陰離子自由基(·)吸收峰一致［14］，當(dāng)歸屬于體系所產(chǎn)生·的瞬態(tài)吸收。緊續(xù)其后，330nm處出現(xiàn)另一瞬態(tài)吸收峰，其在7μs后達(dá)到最大值，該吸收峰歸屬于橙皮苷的酚氧自由基特征吸收。圖7為該反應(yīng)體系所產(chǎn)生的硫酸根陰離子自由基(·)在480nm處以及橙皮苷的酚氧自由基在330nm處的生成－衰減動(dòng)力學(xué)曲線。由圖7可以看出，酚氧自由基的生成曲線明顯緩于·的生成曲線，可以推測(cè)體系中首先產(chǎn)生·，隨后氧化橙皮苷，使橙皮苷陽(yáng)離子自由基脫質(zhì)子反應(yīng)，最終生成橙皮苷酚氧自由基。對(duì)于柚皮苷來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生柚皮苷酚氧自由基的特征吸收在330nm處(見(jiàn)圖6)，在此不再重復(fù)敘述。

圖3 N2O飽和的橙皮苷水溶液脈沖輻解后分別在320nm和400nm處記錄的生成和衰減曲線

圖4 N2O飽和的柚皮苷水溶液脈沖輻解后分別在320nm和400nm處記錄的生成和衰減曲線

圖5 N2飽和的含有特丁醇和過(guò)硫酸鉀的橙皮苷水溶液分別脈沖輻解1μs和7μs后獲得的瞬態(tài)吸收光譜圖

圖6 N2飽和的含有特丁醇和過(guò)硫酸鉀的柚皮苷水溶液分別脈沖輻解0.5μs和11μs后獲得的瞬態(tài)吸收光譜圖

其反應(yīng)可歸納如下:

橙皮苷和柚皮苷均屬黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)可包括黃酮、黃烷酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷酮醇等多種類型。黃酮類物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)是黃烷母核(如圖9所示)，由分布在三個(gè)環(huán)中(C6－C3－C6)的15個(gè)碳原子構(gòu)成，被標(biāo)為A，B，C。不同類型的黃酮類物質(zhì)氧化性能和取代C環(huán)的形式各異，同一類型不同個(gè)體的黃酮類物質(zhì)取代A環(huán)和B環(huán)的形式不同［1］。黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用機(jī)理與它們的結(jié)構(gòu)活性息息相關(guān)，有三個(gè)結(jié)構(gòu)基團(tuán)對(duì)于自由基的清除具有重要的決定作用［15］:a.對(duì)與所有2，3－單鍵的黃酮類物質(zhì)，B環(huán)中的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)是自由基的攻擊點(diǎn)。而鄰苯二酚基團(tuán)參與電子的轉(zhuǎn)移，也賦予酚氧自由基較高的穩(wěn)定性;b.2，3－雙鍵跟4－氧代功能基團(tuán)的聯(lián)結(jié)，對(duì)于從B環(huán)的電子轉(zhuǎn)移有重要作用;c.3－羥基和5－羥基的存在可以使自由基的清除潛能最大化并能強(qiáng)烈吸收自由基。所以，黃烷酮在清除自由基時(shí)，主要是B環(huán)上的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)在起決定性作用，如果把B環(huán)的3’－羥基移去(如柚皮苷)，則抗氧化能力下降。單個(gè)的4’－羥基基團(tuán)可用于清除自由基，若被甲基化(如橙皮苷)，則削弱了其清除能力。不過(guò)由于橙皮苷中4’－甲氧基的取代能活化3’－OH，比柚皮苷中4’－OH 的活性要強(qiáng)［16］，故其清除自由基的能力比柚皮苷強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)橙皮苷、柚皮苷分別與羥基自由基反應(yīng)的表觀速率常數(shù)的差異也證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖7 N2飽和的含有特丁醇和過(guò)硫酸鉀的橙皮苷水溶液脈沖輻解后分別在330nm和480nm處記錄的生成和衰減曲線

圖8 N2飽和的含有特丁醇和過(guò)硫酸鉀的柚皮苷水溶液脈沖輻解后分別在330nm和450nm處記錄的生成和衰減曲線

圖9 黃酮類物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)

對(duì)于抗氧化活性物質(zhì)，其抗氧化活性機(jī)理除了抑制活性氧的形成和清除活性氧之外，還包括螯合一些能促進(jìn)自由基生成的微量元素［17］，所以它們的作用效果往往是雙重的(比如黃酮類物質(zhì))。黃酮類物質(zhì)中對(duì)于微量元素的結(jié)合部位是在B環(huán)的鄰苯二酚部分，C環(huán)上的3－羥基、4－氧代基團(tuán)和C環(huán)和A環(huán)之間的4－氧代、5－羥基基團(tuán)。不過(guò)對(duì)于金屬螯合能力，3－OH和鄰苯二酚結(jié)構(gòu)比5－OH要重要，像柚皮苷那樣只能通過(guò)5－OH、4－氧代部分來(lái)螯合的物質(zhì)是弱的金屬螯合劑［16］，不過(guò)通過(guò)5－OH來(lái)螯合的化合物穩(wěn)定性更好［18］。由此，可以推測(cè)橙皮苷的金屬螯合能力略強(qiáng)于柚皮苷。盡管越來(lái)越多的研究表明，黃酮類物質(zhì)在體外具有抗氧化活性，在體內(nèi)的抗氧化效果卻知之甚少，這可能歸咎于人們對(duì)其在人體內(nèi)的生物學(xué)活性了解的不夠詳盡。對(duì)于抗氧化活性而言，橙皮苷和柚皮苷A環(huán)上糖基化削弱了自由基的清除能力。不過(guò)數(shù)據(jù)顯示，黃烷酮(flavanones)的生物學(xué)活性與糖苷部分相關(guān)［19］。由健康志愿者口頭攝入的柚皮苷也是以糖苷的形式被人體吸收［20］。

3 結(jié)論

橙皮苷和柚皮苷能快速清除羥基自由基。瞬態(tài)反應(yīng)均產(chǎn)生了穩(wěn)定的酚氧自由基;二者與羥基自由基反應(yīng)的表觀速率常數(shù)分別為8.38×105、6.48×105s－1。橙皮苷和柚皮苷是天然有效的自由基清除劑。

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Study on antioxidant activity and mechanism of hesperidin and naringin by pulse radiolysis

BAO Xiao－dan1，XU Chen2，HUANG Juan1，MA Jian－h(huán)ua1，*
(1.College of Bioscience Engineering，Jimei University，F(xiàn)ujian 361021，China;2.Third Institute of Oceanography，National Bureau of Oceanography，F(xiàn)ujian 361021，China)

TS255.1

A

1002－0306(2010)08－0115－04

2009－09－22 *通訊聯(lián)系人

鮑小丹(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物的抗氧化活性研究。

福建省自然科學(xué)基金(2009J01032);福建省教育廳基金(JA08136);廈門(mén)市集美區(qū)科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(350211Z20092C01);集美大學(xué)中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專向基金(2006A003)。