槲蕨提取物體外抗氧化活性研究

汲廣全，鄧 靖，莫正昌，楊 娟

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025;2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550002)

槲蕨提取物體外抗氧化活性研究

汲廣全1，2，鄧 靖1，2，莫正昌1，2，楊 娟2，*

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025;2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550002)

采用二苯代苦味基肼自由基(DPPH·)法和水楊酸法兩種常用的體外抗氧化活性評價方法，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水作為樣品提取劑，對槲蕨不同極性溶劑提取物抗氧化能力進(jìn)行分析，以抗壞血酸(VC)作陽性對照。結(jié)果表明，除粗多糖外，槲蕨各部分提取物都表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH·活性。其中乙酸乙酯提取物對DPPH·自由基的清除能力最強(qiáng)，半清除率濃度為0.032mg/mL;槲蕨水提部分和粗多糖具有一定的清除羥基自由基的能力，但要弱于VC。

槲蕨，提取物，抗氧化能力，清除自由基

Abstract:DPPH·(2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl)method and salicylic acid method were used to evaluate the antioxidant activities in vitro of petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n－ butanol and water extracts from Drynaria fortunei.The results showed that except crude polysaccharide，the extracts had good scavenging activities for DPPH radical.Especially，ethyl acetates extracts showed a higher activity and its half elimination ratio(IC50)was 0.032mg/mL.Water extracts and crude polysaccharide showed certain hydroxyl radical scavenging activity，but the antioxidant activitie was weaker than that of VC.

Key words:Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm;extracts;antioxidant activity;free radical scavenging

槲蕨為槲蕨科植物槲蕨［Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm］的干燥根莖，又名爬巖姜、骨碎補(bǔ)，具有補(bǔ)腎、活血、止血的功能?，F(xiàn)代藥理研究表明，槲蕨對骨的發(fā)育生長具有促進(jìn)作用，能增加骨痂厚度，提高骨折愈合質(zhì)量，防治藥物中毒性耳鳴，并具有降血脂、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜作用［1－4］。目前，人們普遍認(rèn)為天然抗氧化物可抑制自由基反應(yīng)，最終可能改善健康，減少癌癥、心血管疾病和減緩衰老［5］。天然物質(zhì)抗氧化研究在醫(yī)藥學(xué)［6］、保健與功能食品［7］、美容養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚［8］等研究領(lǐng)域均具有非常重要的意義。槲蕨化學(xué)成分主要含有黃烷類化合物、三萜類化合物［9］。關(guān)于槲蕨提取物及其主要成分的抗氧化活性目前還尚未見報道，本實(shí)驗(yàn)通過對槲蕨提取物體外抗氧化活性進(jìn)行評價，為今后更好地開發(fā)利用這一藥用資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥材 于2008年6月購自貴州省貴陽市萬東橋藥材市場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文副教授鑒定為槲蕨科植物槲蕨［Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm］的干燥根莖;二苯代苦味基肼自由基(DPPH·) 百靈威公司;VC、無水乙醇、H2O2、水楊酸、硫酸亞鐵 均為國產(chǎn)分析純試劑。

HP－8453型紫外可見分光光度計(jì) 惠普公司;JA2003精密電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;DK－98－11電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取與制備 稱取槲蕨干燥根莖1.2kg，粉碎后用80%乙醇回流提取7次，每次2h，乙醇提取液減壓濃縮至無醇味，得槲蕨總醇提物。取槲蕨總醇提物20g，用水混懸均勻后倒入分液漏斗中，按2∶1體積比依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。各萃取液及正丁醇萃取后剩下的水層部分分別減壓濃縮至固體，真空干燥后分別得到石油醚提取物1.7g、氯仿提取物3.2g、乙酸乙酯提取物2.4g、正丁醇提取物3.4g以及水層部分2.9g，各提取部分作為待測樣品置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 槲蕨提取物對DPPH·清除活性的IC50值

將乙醇浸提后的槲蕨藥材殘?jiān)谑覝叵聯(lián)]干乙醇，加入殘?jiān)|(zhì)量10倍的蒸餾水，在沸水浴下回流提取7次，每次2h。提取液過濾，濾液合并，濃縮至小體積，加入95%乙醇沉淀濾液中多糖(乙醇最終濃度不小于80%)。沉淀真空干燥后得槲蕨水提粗多糖170g，作為待測樣品置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 槲蕨提取物抗氧化活性的測定

1.2.2.1 對 DPPH·自由基清除能力的測定［10］DPPH·自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在有機(jī)溶劑中呈紫色，在517nm波長有較大吸收。當(dāng)加入抗氧化劑時，一部分自由基被清除掉，使在該波長下吸收減弱，可借此來評價某物質(zhì)的抗氧化活性。準(zhǔn)確稱取各萃取物50mg，用無水乙醇溶解并定容于25mL容量瓶;準(zhǔn)確稱取正丁醇萃取后的水層部分和粗多糖各50mg，蒸餾水溶解并定容于25mL容量瓶，配制得2mg/mL的樣品，再以該質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)配制成各所需樣品濃度;以無水乙醇配制0.16mol/L DPPH·，置于棕色容量瓶中。取3mL樣品溶液加入3mL DPPH·溶液于25℃水浴中加熱15min后，在517nm測得試樣吸光度(Ai)，取3mL蒸餾水代替樣品測得空白吸光度(A0)，以3mL樣品中加入3mL蒸餾水測得樣品本底吸光度(Aj)，其中(Ai)每個樣品質(zhì)量濃度做三個平行，取平均值。以抗壞血酸作陽性對照，按下式計(jì)算清除率:K(%)=［A0－(Ai－Aj)］/A0×100%。

1.2.2.2 對羥基自由基清除能力的測定［11］采用Fenton反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH自由基，在該體系中加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm處有最大吸收。準(zhǔn)確稱取各萃取物50mg，用無水乙醇溶解并定容于25mL容量瓶;準(zhǔn)確稱取粗多糖50mg，蒸餾水溶解并定容于25mL容量瓶，配制得質(zhì)量濃度2mg/mL的各樣品，再以該質(zhì)量濃度配制成所需樣品濃度。依次加入樣品4mL，9mmol/L FeSO40.5mL，9mmol/L 水楊酸 0.5mL，8.8mmol/L H2O20.5mL，該體系于37℃水浴中加熱30min，于510nm測定得樣品吸光度(Ai)，將體系中的樣品改為加入4mL蒸餾水，測定得空白對照吸光度(A0)，當(dāng)向體系中加入 0.5mL蒸餾水代替8.8mmol/L H2O2時，測定得樣品本底吸光度(Aj)，其中(Ai)每個質(zhì)量濃度做三個平行，取平均值，以抗壞血酸作陽性對照，按下式計(jì)算清除率:K(%)=［A0－(Ai－Aj)］/A0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 對DPPH·自由基的清除作用

由圖1可以看出，各個部分對DPPH·自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，其中乙酸乙酯、氯仿和正丁醇提取部分在濃度為0.025～0.1mg/mL時具有明顯的量效關(guān)系，而石油醚和水提部分在0.025～0.2mg/mL時具有明顯的量效關(guān)系。清除能力大小依次為VC＞乙酸乙酯部分＞氯仿部分＞正丁醇部分＞水提部分＞石油醚部分＞粗多糖。尤其是乙酸乙酯部分的量效關(guān)系曲線斜率較大，與VC接近，表明該部分提取物成分對DPPH·自由基具有較高的清除率。

圖1 槲蕨提取物對DPPH·自由基的清除作用

從表1可以看出，槲蕨提取物對DPPH·自由基的半清除率濃度(IC50)大小依次是VC＜乙酸乙酯提取物＜氯仿提取物≈正丁醇提取物＜水層部分＜石油醚提取物。尤其是乙酸乙酯部分的IC50值較接近VC的，提示該部分提取物具有良好的應(yīng)用價值。

由于粗多糖清除DPPH·自由基的活性較低，多糖底色的影響比較大，因此未對高濃度多糖樣品進(jìn)行測定，也未能測出IC50。

2.2 對羥基自由基的清除作用

羥基自由基(·OH)被公認(rèn)是生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧，能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷。因此，我們同時采用Fenton反應(yīng)方法測定了槲蕨中水溶性粗多糖和水提部分對羥基自由基的清除能力。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，粗多糖清除羥基自由基的能力要稍好于水層部分，但粗多糖清除羥基自由基的活性要遠(yuǎn)低于VC，其他提取物對羥基自由基沒有清除作用。

圖2 槲蕨提取物對·OH自由基的清除作用

3 討論

從實(shí)驗(yàn)所選的兩種體外抗氧化活性評價方法中可以看出，槲蕨提取物對DPPH·自由基的清除能力要優(yōu)于羥基自由基。在同一個抗氧化評價指標(biāo)中，不同溶劑提取物的抗氧化能力存在較大差異。在對DPPH·自由基的清除作用中，提取溶劑極性中等的乙酸乙酯、氯仿和較大極性的正丁醇部分提取物的抗氧化能力大于低極性的石油醚部分、高極性的水部分和粗多糖。要弄清槲蕨各提取物抗氧化能力存在的差異，需要進(jìn)一步對各部分的成分進(jìn)行研究。

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Study on antioxidant activity of Drynaria fortune extracts in vitro

JI Guang－quan1，2，DENG Jing1，2，MO Zheng－chang1，2，YANG Juan2，*
(1.College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China;2.Key Laboratory of Chemistry for Natural Products，Chinese Science Academy of Guizhou Province，Guiyang 550002，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0065－03

2009－06－25 *通訊聯(lián)系人

汲廣全(1982－)，男，在讀碩士，研究方向:藥食資源利用。

國家自然科學(xué)基金(30760297);國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2009CB526512)。