食物過敏原水牛乳β-乳球蛋白的交叉反應研究

李 欣，文學方，武 涌，陳紅兵，*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047)

食物過敏原水牛乳β-乳球蛋白的交叉反應研究

李 欣1，2，文學方1，2，武 涌1，2，陳紅兵1，2，*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047)

β－乳球蛋白是乳清中一種主要蛋白質(zhì)，而且是乳中主要過敏原之一。本研究探討β－乳球蛋白與其它蛋白的免疫交叉反應性。采用間接ELISA法和免疫印跡的方法，利用β－乳球蛋白和相應的多克隆抗體，檢測其交叉反應。結(jié)果表明，β－乳球蛋白不僅與水牛乳中其它蛋白有交叉反應，與其他乳源的β－乳球蛋白也有交叉反應。β－乳球蛋白的交叉反應較強，也是導致乳類食物過敏的主要原因之一。

過敏，β－乳球蛋白，交叉反應

Abstract:β－lactoglobulin is a main protein in whey and well－known to be one of major allergens in milk.The crossreactivity of buffalo β－lactoglobulin with other proteins from milk was studied.The experiment was tested by indirect ELISA and westernblotting.The results showed that cross－reactivity occured not only among the differernt proteins but also milk from different resource.It was concluded that β－lactoglobulin had strong cross－reactivity with other proteins，which is the main reason to milk allergy.

Key words:allergy;β－lactoglobulin;cross－reactivity

牛乳過敏是一種常見的食物過敏反應，牛乳β－乳球蛋白被視為最主要的乳過敏原蛋白之一。據(jù)文獻報道，82%的牛乳過敏患者對牛乳β－乳球蛋白過敏［1］。β－乳球蛋白屬于強過敏原Lipocalin家族，而人乳中又缺乏β－乳球蛋白［2］，所以牛乳β－乳球蛋白的過敏問題引起了廣泛的關注。水牛乳被譽為“奶中之王”，它在安全性、營養(yǎng)價值、加工特性等方面具有其它畜乳不可比擬的優(yōu)勢。目前，反芻動物乳是人類重要的食物蛋白來源之一，但由于在反芻動物乳中乳蛋白成分同源性較高，都含有一些主要的過敏原，如酪蛋白、β－乳球蛋白、α－乳白蛋白等，存在著較強的免疫交叉反應［3－4］。因此，隨著水牛乳消費的增多，水牛乳過敏問題也必將不斷呈現(xiàn)。β－乳球蛋白是水牛乳中的一種主要蛋白質(zhì)，目前的相關研究較少且主要集中在對其一些理化性質(zhì)的分析，缺乏免疫活性研究［3，5］。本研究以純化的水牛乳β－乳球蛋白為抗原，按常規(guī)的免疫程序?qū)θ毡敬蟀锥眠M行免疫，通過間接ELISA和免疫印跡的實驗，對其交叉反應進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

日本大白耳兔 8周齡，雄性，體重約為3kg，飼養(yǎng)于江西省實驗動物質(zhì)量檢測站;純化的水牛乳β－乳球蛋白 本實驗室自制;牛乳β－乳球蛋白純品(純度達90%以上)、豬源的明膠、羊抗兔酶標二抗，鄰苯二胺(OPD) 購自Sigma公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等常規(guī)的分析性試劑 購自上海生工公司。

高速冷凍離心機 BACKMAN公司;酶聯(lián)免疫檢測儀(model860)Bio－Rad公司;恒溫箱 SANYO公司;迷你型蛋白電泳儀和電轉(zhuǎn)儀 Bio－Rad公司;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多抗的制備 實驗動物分為兩組，對照組(2只)和實驗組(4只)，實驗組4只兔子分別標號為1，2，3，4;兔1和兔2用純化的水牛乳β－乳球蛋白免疫，兔3和兔4用牛乳β－乳球蛋白純品免疫;水牛乳免疫動物所用的佐劑為弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，采用的免疫途徑為皮下多點注射方式，抗原免疫所需劑量為每只兔子1mg/mL，每兩周免疫一次，共免疫4次。

實時檢測抗體效價，當效價達到一定程度，動脈取血并分離血清。采集的血清先傾斜置于室溫放置0.5h凝血，然后4℃冰箱放置過夜，離心分離血清(4000r/min，3min)，分裝，－20℃凍存［6］。

1.2.2 方陣滴定確定抗原包被的最佳濃度 以0.5～80μg/mL抗原濃度包被，每一濃度包被一行，二抗分別作 1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶10000、1∶20000 稀釋，每一稀釋度加一列，作方陣滴定，確定最佳抗原包被濃度和二抗稀釋倍數(shù)。所用抗血清為1∶100稀釋度的免疫后第4周兔血清。

1.2.3 間接ELISA測抗體效價

1.2.3.1 包被 96孔酶標板，每孔加入100μL的包被抗原(濃度2.5μg/mL)，4℃過夜。

1.2.3.2 洗滌 恢復至室溫，傾去包被液，每孔加PBST 300μL洗滌3次，每次5min，扣干。

1.2.3.3 封阻 每孔加250μL 1%的明膠作為封阻液，37℃保溫保濕1h?；謴椭潦覝兀瑑A去封阻液，PBST滿孔洗滌3次，每次5min，扣干。

1.2.3.4 加待測血清 每孔加入100μL用PBS倍比稀釋的抗血清和陰性血清，同時設置空白對照(加PBS)，37℃保溫保濕1h后，用PBST洗滌，扣干三次。

1.2.3.5 加酶標二抗 每孔加入100μL 1∶5000稀釋的HRP標記羊抗兔 IgG，37℃保溫保濕1h后，以PBST洗滌扣干三次。

1.2.3.6 顯色 每孔加入反應底物100μL，37℃保溫避光反應15min。

1.2.3.7 終止反應 每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4終止反應。

1.2.3.8 比色 在490nm測吸光值。以P/N＞2，且P＞0.2時抗血清的最大稀釋倍數(shù)為抗血清效價，其中P為陽性血清的OD490，N為陰性血清的OD490。

1.2.4 免疫印跡

1.2.4.1 電泳 先恒流15mA，15min，再恒流45mA，40min。

1.2.4.2 電轉(zhuǎn) 先將PVDF膜放到轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min，然后用蒸餾水沖洗，進行電轉(zhuǎn)，恒流40mA，1h。

1.2.4.3 封阻 1%的明膠作為封阻液，37℃保溫保濕1h，TBT洗滌每次溫育洗10min，洗3次。

1.2.4.4 一抗 稀釋3000倍的抗血清將膜浸沒，37℃溫育1h，TBST洗滌每次溫育洗10min，洗3次。

1.2.4.5 二抗 1∶5000稀釋的HRP酶標羊抗兔IgG二抗，37℃保溫保濕1h后，TBST洗滌每次溫育洗10min，洗3 次。

1.2.4.6 顯色 4－氯－1－萘酚染色5min即可。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫反應的效價跟蹤

通過方陣滴定法確定最佳包被濃度為2.5μg/mL，采用間接ELISA法跟蹤免疫動物抗體效價的升高，達到所需要求，大量采血。圖1為實驗組四只兔子免疫過程中效價的變化。從圖中可看出，多克隆抗體的制備方案可以得到高效價特異性抗體。當免疫到第四次即第七周時抗體的效價都有明顯上升，且兔1和兔2的抗體效價要高于兔3和兔4的。效價最高為兔1，達1∶80萬以上。

圖1 免疫動物的抗體滴度變化

2.2 水牛乳β－乳球蛋白(牛乳β－乳球蛋白)與其它牛乳蛋白的免疫交叉反應

圖2為通過間接ELISA法測定牛乳蛋白之間的交叉反應的結(jié)果?？顾Ｈ棣拢璴g和抗牛乳β－lg血清分別與牛乳中酪蛋白、α－乳白蛋白、牛血清白蛋白的免疫反應，可以評估水牛乳和牛乳β－lg與其它乳蛋白的免疫交叉反應。

圖2 水牛乳β－乳球蛋白(牛乳β－乳球蛋白)與其它牛乳蛋白的免疫交叉反應

結(jié)果表明，BSA、酪蛋白和α－乳白蛋白與β－乳球蛋白均存在交叉反應，其中BSA與兩種血清反應的效價是相同的，說明BSA與兩種血清的反應沒有特異性。其余三種蛋白均與抗水牛乳的血清反應較強。我們分析產(chǎn)生免疫交叉反應原因是由于純化的水牛乳β－乳球蛋白中可能含有痕量的這些雜蛋白，然后免疫動物時產(chǎn)生了既針對水牛乳β－乳球蛋白的特異性抗體，又產(chǎn)生了針對這些雜蛋白的特異性抗體。

2.3 抗水牛乳β－乳球蛋白多克隆抗體與其他哺乳動物乳粗蛋白的交叉反應

圖3為不同來源的乳的粗蛋白與β－乳球蛋白的免疫印跡結(jié)果。從圖中可以看到，在 β－乳球蛋白所對應的17kDa的位置，除了母乳均有較粗的條帶，說明水牛乳的血清與其他乳中的β－乳球蛋白交叉反應強烈。而母乳中不含β－乳球蛋白，因此沒有免疫反應。同時可看到第二泳道中牛乳乳清與抗血清免疫反應的條帶最多，印證了圖2的結(jié)果，水牛乳和牛乳之間存在較強的交叉反應，其次是山羊乳乳清，其在34kDa有一條細條帶;豬乳乳清中的蛋白也只是與β－乳球蛋白的反應，說明與其他蛋白沒有交叉反應。

圖3 四種不同來源乳與抗水牛乳β－乳球蛋白的抗體的免疫印跡圖

3 討論

交叉反應一般發(fā)生在同源性較高或是有相似的抗原決定簇的蛋白之間。母乳蛋白與β－乳球蛋白沒有交叉反應，這是由于母乳中不存在β－乳球蛋白，而且其它蛋白與β－乳球蛋白也沒有交叉反應，因此有研究發(fā)現(xiàn)對牛乳過敏的兒童食用母乳后過敏癥狀會消失。Conti等發(fā)現(xiàn)，人β－酪蛋白的C末端與抗牛乳的β－乳球蛋白的抗體可發(fā)生特異性結(jié)合，這是蛋白之間序列同源性較高所致［7］。本研究制備了抗水牛乳β－乳球蛋白的兔多克隆抗體，在抗水牛乳β－乳球蛋白整個純化過程中保持了良好的免疫活性。間接ELISA和免疫印跡結(jié)果表明，水牛乳β－乳球蛋白和牛乳β－乳球蛋白存在較強的免疫交叉反應。

［1］AokiT，Iskandar S，Yoshida T，et al.Reduced immunogenicity of beta－ lactoglobulin by conjugating with chitosan［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2006，70(10):2349－2356.

［2］Virtanen T.Lipocalin allergens［J］.Allergy，2001，56(Suppl 67):48－51.

［3］Spanghero M，Susmel P.Chemical composition and energy content of buffalo milk［J］.J Dairy Res，1996，63(4):629－633.

［4］Restani P，Beretta B，F(xiàn)iocchiA，et al.Cross－reactivity between mammalian proteins［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2002，89(6 Suppl 1):11－15.

［5］Asmad S，Gaucher I，Rousseau F，et al.Effect of acidification on physico－chemical characteristics of buffalo mik:a comparison with cow＇s milk［J］.Food Chem，2008，106:11－17.

［6］Addou－Benounane S，Tome D，Kheroua O，et al.Parenteral immunization tobeta－lactoglobulin modifiesthe intestinal structure and mucosal electrical parameters in rabbite［J］.Int Immunopharmacol，2004，4(12):1559－1563.

［7］Conti A，Giuffrida M，Napolitano G，et al.，Identification of the human beta－casein C－terminal fragments that specifically bind to purified antibodies to bovine beta－ lactoglobulin［J］.J Nutr Biochem，2000，11(6):332－337.

Study on cross－reactivity of food allergen buffalo β－lactoglobulin

LI Xin1，2，WEN Xue－fang1，2，WU Yong1，2，CHEN Hong－bing1，2，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China;2.Sino－German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

TS201.2+1

A

1002－0306(2010)08－0149－03

2009－07－24 *通訊聯(lián)系人

李欣(1980－)，女，博士后在站，研究方向:食品生物技術。

國家自然基金(30560096＆30860220);“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助”(NCET－08－0704，2009－2011);目標導向項目;研究生創(chuàng)新專項基金項目。