牛蒡葉多酚的超聲波輔助提取及抗氧化活性、成分分析研究

婁在祥，王洪新，陳尚衛(wèi)，朱 松，張 明，高 揚(yáng)

(江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

牛蒡葉多酚的超聲波輔助提取及抗氧化活性、成分分析研究

婁在祥，王洪新*，陳尚衛(wèi)，朱 松，張 明，高 揚(yáng)

(江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

利用超聲波輔助法提取多酚，并研究了提取物的抗氧化活性和多酚成分。結(jié)果表明，超聲波功率、提取時(shí)間的增大對(duì)多酚提取具有明顯促進(jìn)作用。通過實(shí)驗(yàn)得出了超聲波輔助法提取多酚的最佳條件為:提取時(shí)間30min，超聲波功率200W，提取溫度30℃，液料比20∶1mL/g。在此條件下，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出，多酚提取率平均值為8.810mg/g。DPPH自由基實(shí)驗(yàn)、羥自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛蒡葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，牛蒡葉提取物濃度為1.00mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為51.56%。牛蒡葉多酚的主要成分為綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、蘆丁等。牛蒡葉提取物的強(qiáng)抗氧化活性主要是這些多酚化合物共同作用的結(jié)果。

牛蒡葉多酚，超聲波，提取，活性，成分

Abstract:Ultrasonic technique was employed to extract phenolics from burdock leaves.The effects of four independent variables(time，ultrasonic power，temperature and solvent to solid ratio)on the recovery of phenolics from burdock leaves were evaluated.The optimal conditions for ultrasonic extraction of phenolics were determined.The optimal conditions to obtain the highest recovery of phenolics were:30min of extracting time，200W of ultrasonic power，30℃ of extraction temperature and 20∶1mL/g of solvent to solid ratio.Under these optimal conditions，the recovery of phenolics was 8.810mg/g.The experiments indicated that the antioxidant activity(DPPH radical scavenging ability，hydroxyl radical scavenging capability)of the extracts from burdock leaves was very high.It was found that the extract of burdock leaves containd chlorogenic acid，o－h(huán)ydrobenzoic acid，caffeic acid，rutin，p－coumaric acid，etc.The high antioxidant activity is probably due to the combined action of these phenolic compounds present in the extract.

Key words:phenolics from burdock leaves;ultrasonic;extraction;activity;composition

牛蒡作為一種優(yōu)質(zhì)蔬菜，在中國(guó)和日本等國(guó)家被廣泛食用，其種植規(guī)模逐年遞增。然而，在生產(chǎn)過程中大量牛蒡葉被丟棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，同時(shí)容易污染環(huán)境。而牛蒡葉中含有的多酚物質(zhì)具有抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜等功效［1］，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有顯著效果［2－3］。它是大多數(shù)氧自由基的清除劑，能夠抗衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫［3］。因此對(duì)牛蒡葉中的多酚成分進(jìn)行開發(fā)利用，既可以綜合利用廢棄資源，又可以制備大量的活性成分，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。然而，當(dāng)前有關(guān)牛蒡葉多酚的分離及活性的研究很少，對(duì)牛蒡葉多酚成分的抗氧化活性的系統(tǒng)性研究未見報(bào)道。提取是研究活性成分的關(guān)鍵步驟。超聲波輔助提取可以顯著加速傳質(zhì)過程，提高提取效率，并且容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。與傳統(tǒng)的提取方式比較，具有提取時(shí)間短、提取效率高等明顯優(yōu)勢(shì)。然而，超聲波輔助提取牛蒡葉多酚未見報(bào)道。本文以牛蒡葉為原料，利用超聲波輔助提取多酚物質(zhì)，優(yōu)化多酚的提取條件，并探討了多酚的抗氧化活性，分析了多酚成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡葉 產(chǎn)地為徐州，晾干，密封避光保存;綠原酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、蘆丁、沒食子酸、兒茶素、o－h(huán)ydrobenzoic acid Sigma公司。

高效液相色譜儀1100 PDA檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司;超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波輔助法提取牛蒡葉多酚 準(zhǔn)確稱取牛蒡葉粉末5g，加100mL 70%的乙醇溶液［4］，在超聲波作用下，浸提，離心，取上清液，待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別取100、200、400、600、800、1000μL的0.200mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)足到1000μL。然后依次加入Folin－Ciocalteu顯色劑1mL、10%碳酸鈉溶液2mL，25℃反應(yīng)1h。用分光光度計(jì)測(cè)定在765nm處的吸光度A［5］。以吸光度值為縱坐標(biāo)，以沒食子酸的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，建立回歸方程。

1.2.3 多酚含量測(cè)定 取多酚提取液1mL，按照1.2.2的方法測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出多酚含量。

多酚提取率(mg/g)=多酚質(zhì)量(mg)/所用的牛蒡葉質(zhì)量(g) 式(1)

1.2.4 DPPH自由基實(shí)驗(yàn)［6］將牛蒡葉提取液真空濃縮，真空冷凍干燥，得牛蒡葉提取物粉末，用無(wú)水乙醇溶解。將待測(cè)的牛蒡葉提取物稀釋成系列溶液，按表1加樣，避光反應(yīng)10min后在517nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

DPPH 自由基清除率(%)=［1－(Ai－Aj)/A0］×100% 式(2)

表1 DPPH實(shí)驗(yàn)加樣表及相應(yīng)的吸光值

1.2.5 羥自由基實(shí)驗(yàn)［7］取2.0mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4，下同)和4.0mL蒸餾水于試管中，混勻作空白參比管;取2.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲(1.5mmol/L，下同)、1.0mL FeSO4(1.5mmol/L，下同)和2.0mL蒸餾水于試管中，混勻作未損傷管;取2.0mL PBS，1.0mL 鄰二氮菲，1.0mL FeSO4，1.0mL 蒸餾水和1.0mL H2O2(0.02%)于試管中，混勻作損傷管;取2.0mL PBS，1.0mL牛蒡葉提取液和3.0mL蒸餾水于試管中，混勻作樣品參比管;取2.0mL PBS、1.0mL鄰二氮菲，1.0mL FeSO4，1.0mL牛蒡葉提取液和1.0mL H2O2于試管中，混勻作樣品管。將上述試管37℃保溫60min，于波長(zhǎng)536nm處測(cè)吸光度(A)值，重復(fù)3次。按下式計(jì)算羥自由基清除率。

羥自由基清除率(%)= ［(A樣品－A樣參)－(A損傷－A空參)］/(A未損－A損傷)×100% 式(3)1.2.6 牛蒡葉多酚成分HPLC分析 自動(dòng)進(jìn)樣(5μL)，上柱(分離柱 ODS C180.46mm ×250mm)，柱溫35℃，流動(dòng)相:A泵，0.05%冰乙酸;B泵，甲醇，采用梯度程序洗脫，其中:1%B(0min)→61%B(25min)，總 流 量 0.8mL/min。紫 外 檢 測(cè) 器UV280nm檢測(cè)多酚組分，以標(biāo)準(zhǔn)品在色譜柱上的保留時(shí)間為對(duì)照，同時(shí)比較樣品成分與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收?qǐng)D譜，判斷各多酚成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波功率對(duì)牛蒡葉多酚提取的影響

在液料比(v/w，mL/g，下同)為 20∶1，提取時(shí)間為20min，提取溫度為30℃的條件下，超聲波功率對(duì)多酚提取的影響見圖1。

圖1 超聲波功率對(duì)多酚提取的影響

由圖1可看出，超聲波功率提高時(shí)，多酚提取率隨之增大。這是因?yàn)椋β试龃髸r(shí)，擴(kuò)散、溶解速度都大大加快，同時(shí)，超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)引起細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化及細(xì)胞壁的破壞，從而加速了多酚由細(xì)胞向溶液中的轉(zhuǎn)移。因此，一定范圍內(nèi)提高功率可以提高多酚的提取率;當(dāng)功率達(dá)到200W時(shí)，多酚提取率的增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。因此，超聲波功率以200W為佳。

2.2 提取時(shí)間對(duì)多酚提取的影響

在液料比為20∶1，超聲波功率為200w，提取溫度為30℃的條件下，提取時(shí)間對(duì)多酚提取的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多酚提取的影響

由圖2可看出，隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率呈先上升、最后略微下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槌^30min后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波使少量多酚分解。由圖2可知，最適提取時(shí)間為30min。

2.3 液料比對(duì)多酚提取的影響

在超聲波功率為200W，提取時(shí)間為30min，提取溫度為30℃的條件下，液料比對(duì)多酚提取的影響見圖3。

圖3 液料比對(duì)多酚提取的影響

由圖3可以看出，液料比對(duì)多酚提取率有較大影響。隨著液料比的增大，多酚提取率增大，但是到一定程度時(shí)，提取率的增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。所以，超聲波輔助提取法的最佳液料比為20∶1(mL/g)。

2.4 提取溫度對(duì)多酚提取的影響

在液料比為20∶1，超聲波功率200W，時(shí)間為30min的條件下，隨著溫度的升高，反應(yīng)物的能量增加，使反應(yīng)速度加快［8］;超過某一溫度后，溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響不再明顯，另外，多酚在較高溫度及超聲波作用下，還可能會(huì)發(fā)生變質(zhì)。如圖4所示，溫度升高時(shí)，多酚提取率升高，溫度超過30℃時(shí)，多酚提取率不再增長(zhǎng)，然后略有下降，所以最適提取溫度為30℃。

圖4 提取溫度對(duì)多酚提取的影響

2.5 超聲波輔助提取多酚最佳條件的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

以上述實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件，即提取時(shí)間30min，超聲波功率 200W，液料比 20∶1，提取溫度30℃為操作條件，進(jìn)行3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 超聲波輔助提取多酚最佳條件實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

由表2可知，以最佳條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，多酚提取率平均值為8.810mg/g，高于或者近似于前面實(shí)驗(yàn)的多酚提取率，表明了優(yōu)化得到的多酚提取最佳條件的可靠性及準(zhǔn)確性。

2.6 牛蒡葉提取物的抗氧化活性

2.6.1 DPPH清除能力 DPPH清除實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)樣品抗氧化活性的一種應(yīng)用廣泛的方法［9］，與其他方法相比，它耗時(shí)很短，操作簡(jiǎn)便。在這里，牛蒡葉多酚提取物的抗氧化性以對(duì)DPPH自由基的清除率來表示，結(jié)果見表3。

表3 牛蒡葉提取物對(duì)DPPH自由基的清除率

由表3可知，隨著牛蒡葉提取物加入量的增加，樣品對(duì)DPPH自由基清除能力逐步增加。當(dāng)加入牛蒡葉提取物濃度為1.00mg/mL時(shí)，在實(shí)驗(yàn)條件下，超聲波輔助提取所得牛蒡葉提取物對(duì)自由基的清除率約為51.56%。當(dāng)提取物濃度為1.30mg/mL時(shí)，對(duì)自由基的清除率達(dá)60.67%。可見所提取的牛蒡葉提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.6.2 羥自由基清除能力 羥基自由基是一種強(qiáng)氧化劑，是造成組織脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)解聚、聚合核酸斷裂，多糖解聚的重要活性氧。因此對(duì)羥基自由基的清除能力(清除率)是反映提取物抗氧化作用的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)在該反應(yīng)體系中加入鄰二氮菲，鄰二氮菲－Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲－Fe3+后，紅色褪去，吸收峰(536nm)大幅度下降。該體系加入抗氧化物質(zhì)(牛蒡葉提取物)后，反應(yīng)后吸光度的變化得到緩解，其緩解程度可衡量提取物抗氧化作用的相對(duì)強(qiáng)度。由圖5可知，在鄰二氮菲－Fe2+體系中，牛蒡葉提取物對(duì)羥基自由基有明顯清除作用，且呈一定的量效關(guān)系，隨著提取物濃度的增加，清除作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)牛蒡葉提取物濃度為2.50mg/mL時(shí)，其對(duì)自由基的清除率約為51.09%，提取物濃度為2.80mg/mL時(shí)，多酚對(duì)自由基的清除率達(dá)56.79%。

圖5 牛蒡葉提取物對(duì)羥自由基的清除能力

2.7 牛蒡葉多酚成分分析

將牛蒡葉提取物進(jìn)行高效液相色譜法分析，其HPLC圖譜見圖6，牛蒡葉中各種化合物的含量分析見表4。

圖6 牛蒡葉提取物中多酚成分的HPLC色譜圖

表4 牛蒡葉中多酚成分分析

結(jié)果表明，牛蒡葉多酚的主要成分為:綠原酸、o－h(huán)ydrobenzoic acid、咖啡酸、對(duì)香豆酸、蘆丁等。其中綠原酸和蘆丁的含量較高，是牛蒡葉中主要的多酚化合物。劉世明［10］、Ferracane［11］等的研究表明牛蒡葉中含有咖啡酸、綠原酸、蘆丁等，而o－h(huán)ydrobenzoic acid和對(duì)香豆酸的存在未見報(bào)道。

研究表明［12－13］，咖啡酸、綠原酸、蘆丁等具有很強(qiáng)的抗氧化活性。自由基的清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛蒡葉提取物具有顯著的清除DPPH自由基、羥自由基的能力，這些很強(qiáng)的抗氧化活性可能主要?dú)w因于綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、蘆丁等多酚化合物的共同作用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波技術(shù)輔助提取多酚。并考察四個(gè)因素(提取時(shí)間、超聲波功率、提取溫度、液料比)對(duì)多酚提取率的影響。分析得出了超聲波輔助法提取多酚的最佳條件為:提取時(shí)間30min，超聲波功率200W，提取溫度30℃，液料比20∶1。在此條件下，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出，多酚提取率平均值為8.810mg/g。

由結(jié)果可以看出，超聲波處理能夠縮短提取時(shí)間，并且免去了高溫對(duì)活性成分的影響。因此超聲波輔助提取具有十分廣泛的工業(yè)化應(yīng)用前景。

通過DPPH自由基、羥自由基清除實(shí)驗(yàn)測(cè)定了牛蒡葉提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，牛蒡葉提取物具有強(qiáng)抗氧化活性。當(dāng)提取物濃度為1.00mg/mL和1.30mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率分別為約51.56%和60.67%。當(dāng)提取物濃度為2.50mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為51.09%。

HPLC分析表明，牛蒡葉多酚的主要成分為綠原酸、o－h(huán)ydrobenzoic acid、咖啡酸、對(duì)香豆酸、蘆丁等。牛蒡葉提取物的強(qiáng)抗氧化活性可能主要?dú)w因于這些多酚化合物的共同作用。

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Studies on ultrasound－assisted extraction，antioxidant activity and composition of phenolics from burdock leaves

LOU Zai－xiang，WANG Hong－xin*，CHEN Shang－wei，ZHU Song，ZHANG Ming，GAO Yang
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

TS201.2

A

1002－0306(2010)08－0261－04

2009－09－15 *通訊聯(lián)系人

婁在祥(1983－)，男，博士研究生，研究方向:食品功能因子。