響應(yīng)曲面法優(yōu)化文冠果種仁蛋白的堿溶酸沉提取工藝

鄧 紅，田蕓蕓，田子卿，仇農(nóng)學(xué)，郭玉蓉

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化文冠果種仁蛋白的堿溶酸沉提取工藝

鄧 紅，田蕓蕓，田子卿，仇農(nóng)學(xué)，郭玉蓉

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

以文冠果種仁脫脂粉為原料，采用堿溶酸沉法提取文冠果蛋白，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化其提取工藝。運(yùn)用Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白質(zhì)得率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，研究液料比、pH、提取時(shí)間以及提取溫度等影響因素及其交互作用對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，文冠果蛋白質(zhì)堿溶酸沉的最佳提取工藝參數(shù)為:液料比11∶1(mL/g)，pH11，提取時(shí)間73min，提取溫度41℃。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)各影響因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率作用的大小依次為:pH＞液料比＞時(shí)間＞溫度。在此條件下，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到83.58%，利用響應(yīng)面分析法得到的二次多項(xiàng)式回歸方程數(shù)學(xué)模型Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

文冠果，蛋白質(zhì)，提取

Abstract:The Xanthoceras sorbifolia bunge kernel protein was extracted by Alkali－Solution and Acid－Isolation.The extraction processing was optimized through response surface analysis.By use of the Box－Behnken experimental design method，the effects of the ratio of liquid，pH，extraction time and temperature and their interactions on the protein yield were studied on the base of the single－factor test.The test results showed that the optimum conditions of alkali－solution and acid－isolation extraction for Xanthoceras sorbifolia bunge protein were as following:the ratio of liquid 11∶1(mL/g)，pH11，extraction time 73min，extraction temperature 41℃.The influence order of factors to protein extracting rate is pH＞ratio between solid and liquid＞reaction time＞reaction temperature.Under these conditions，the rate of protein extraction reached 83.58%.The mathematic model of the quadratic polynomial regression equation was obtained through the method of response surface analysis which could predict the yield of protein exactly.

Key words:Xanthoceras sorbiflia bunge;protein;extraction

文冠果(Xanthoceras sorbifoLia Bunge)為無患子科文冠果屬落葉喬木或大灌木，是中國(guó)特有的珍稀木本油料樹種，也是中國(guó)北方地區(qū)很有發(fā)展前途的水土保持樹種和珍稀觀賞樹木［1－3］。文冠果種仁既含有大量的油脂，又含有豐富的植物蛋白質(zhì)，據(jù)分析其種仁含油脂58.91%，有14種脂肪酸，不飽和脂肪酸含量高達(dá)94%;種仁含蛋白25.75%，有17種氨基酸，必需氨基酸種類齊全，且氨基酸評(píng)分較高，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［4－6］。蛋白質(zhì)由于種類多、性質(zhì)差異大，因而提取與制備方法也很多。由于大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中，所以可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)。目前，油料蛋白質(zhì)的提取主要有反膠束溶液萃取、等電點(diǎn)沉淀、離子交換、堿溶酸沉、膜分離等方法［7－9］，其中堿溶酸沉法是我國(guó)普遍采用的生產(chǎn)工藝，此法能夠有效地提高產(chǎn)品得率，充分利用蛋白資源。目前關(guān)于文冠果種仁蛋白提取的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)以文冠果種仁脫脂粉為原料，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化文冠果蛋白質(zhì)堿溶酸沉的工藝條件，探討液料比、pH、時(shí)間和溫度等因素對(duì)文冠果蛋白質(zhì)得率的影響，確定最佳工藝參數(shù)，為深入開發(fā)利用文冠果蛋白質(zhì)資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

文冠果籽 購(gòu)于陜西志丹，挑選完整、飽滿、無蟲害的文冠果籽作為實(shí)驗(yàn)原料，手工去殼，種仁粉碎，過40目后冷榨取油，渣餅脫脂后粉碎冷藏備用。95%乙醇 分析純，西安三浦精細(xì)化工廠;氫氧化鈉

分析純，天津市化學(xué)試劑三廠;石油醚 30～60℃，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司;無水硫酸鈉、氫氧化鉀 分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;鹽酸 分析純，天津市津北精細(xì)化工有限公司;酚酞

分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

KDY－9810型凱氏定氮儀 北京市通潤(rùn)機(jī)電有限公司;121MB型氨基酸自動(dòng)分析儀 美國(guó)貝克曼(Beckman)公司;超速粉碎機(jī) 天津市達(dá)康電器公司;真空冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;PHS－3C精密pH計(jì)、JA2003N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠;722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 文冠果蛋白的制備

1.2.1.1 原料預(yù)處理 將文冠果仁渣餅粉碎，45℃下用石油醚(30～60℃)脫脂四次，置通風(fēng)廚中12h以揮發(fā)溶劑，得脫脂粉，于冰箱4℃保存?zhèn)溆?。脫脂文冠果粉中蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用半微量凱氏定氮法。

1.2.1.2 工藝流程 文冠果脫脂粉→堿溶、浸提→離心→等電點(diǎn)沉淀→洗滌→冷凍干燥→文冠果蛋白粉

1.2.1.3 文冠果蛋白的提取步驟［10－12］取一定量脫脂粉與雙蒸水按一定料液比混合，用1mol/L NaOH調(diào)至一定pH，于一定溫度下磁力攪拌器攪拌浸提30min，然后在4℃下以4000r/min離心20min。沉淀物再重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用1mol/L HCl調(diào)pH至等電點(diǎn)以沉淀蛋白質(zhì)，經(jīng)靜置沉淀后，以雙蒸水洗滌沉淀3次，再用1mol/L NaOH回調(diào)pH至7.0，攪拌使沉淀復(fù)溶后真空冷凍干燥，即為文冠果蛋白粉。

1.2.2 堿溶酸沉單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 液料比的確定 分別設(shè)定液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)，50℃，pH 為 10 下浸提80min，研究液料比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響，確定最佳的液料比。

1.2.2.2 pH的確定 液料比10∶1，分別選擇pH為8、9、10、11、12，其他實(shí)驗(yàn)條件同 1.2.2.1，確定最佳的pH。

1.2.2.3 提取時(shí)間的確定 液料比10∶1，pH為10，分別選擇浸提時(shí)間為 40、60、80、100、120min，其他實(shí)驗(yàn)條件同1.2.2.1，確定最佳提取時(shí)間。

1.2.2.4 提取溫度的確定 液料比10∶1，pH為10，浸提時(shí)間60min，分別選擇提取溫度為 30、40、50、60、70℃，研究提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響，確定最佳提取溫度。

1.2.3 堿溶酸沉工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box－Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取液料比(mL/g)、pH、提取時(shí)間(min)及提取溫度(℃)為影響因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用Design－Expert7.1.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。分別用A、B、C、D來表示4個(gè)影響因素，并以+1、0、－1分別代表變量的水平，蛋白質(zhì)得率為響應(yīng)值(即實(shí)驗(yàn)指標(biāo))，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案［13－15］見表 1。

表1 Box－Behnken方案設(shè)計(jì)的中心組合實(shí)驗(yàn)因素和水平編碼表

1.3 分析方法

1.3.1 文冠果粗蛋白含量測(cè)定 粗蛋白按GB/5511－1985 方法進(jìn)行［16－17］(即凱氏定氮法)。

1.3.2 文冠果水溶性蛋白含量測(cè)定 水溶性蛋白:采用考馬斯亮藍(lán)法［16］。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為A=0.0007C+0.0069，其中A為吸光度，C為蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)，R2=0.9995。

圖1 蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 文冠果蛋白提取率計(jì)算

文冠果蛋白提取率(%)［6］=提取液中蛋白質(zhì)含量/脫脂粉總蛋白含量×100%

注:提取液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法為考馬斯亮藍(lán)法;脫脂粉中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法為半微量凱氏定氮法。

2 結(jié)果與討論

2.1 文冠果種仁粗蛋白含量分析

采用凱氏定氮法分析了陜西志丹產(chǎn)地的文冠果種仁粗蛋白含量，其值為22.40%。脫脂粉經(jīng)堿溶酸沉、真空凍干后可獲得較純蛋白，經(jīng)半微量凱氏定氮法測(cè)定其含氮量為6.5642%，蛋白質(zhì)含量為82.06%。

2.2 蛋白質(zhì)提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 按照1.2.2.1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著液料比的增大，蛋白質(zhì)的提取率隨之升高。當(dāng)液料比較小時(shí)，蛋白質(zhì)提取率較低，可能由于文冠果中含有一定量的淀粉和纖維，具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力，使物料流動(dòng)性差難以攪拌，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率低。液料比大于10∶1(mL/g)時(shí)，蛋白提取率增加值已不明顯。所以液料比取10∶1(mL/g)較佳。

圖2 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.2 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 按照1.2.2.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，隨著pH的升高，蛋白質(zhì)提取率增加，且在pH等于10時(shí)提取率達(dá)最大值。pH大于10，則蛋白質(zhì)提取率下降，pH太高可能會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，使得提取率有所降低。所以最佳提取pH為10。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 按照1.2.2.3方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，在時(shí)間小于60min時(shí)，曲線顯著上升，60min到達(dá)峰值，之后有明顯下降的趨勢(shì)。蛋白質(zhì)溶出率越高，蛋白質(zhì)提取率越高。當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到60min時(shí)，蛋白質(zhì)的溶出率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。所以蛋白質(zhì)提取時(shí)間為60min較佳。

2.2.4 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 按照1.2.2.4方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，溫度的高低對(duì)文冠果蛋白質(zhì)溶解度有較大的影響。隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率增大。當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)提取率達(dá)到最大，之后顯著降低?？赡苁且?yàn)榈鞍踪|(zhì)在50～60℃易受熱變性，使蛋白質(zhì)提取率下降。所以最佳提取溫度為50℃。

圖5 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3 堿溶酸沉提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用四因素三水平的響應(yīng)面法進(jìn)行堿溶酸沉提取工藝的優(yōu)化，按照1.2.3的方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 Box－Behnken方案設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design－Expert7.1.6軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到文冠果蛋白質(zhì)得率對(duì)液料比(A)、pH(B)、提取時(shí)間(C)及提取溫度(D)的二次多項(xiàng)回歸模型為:

Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C－0.49D－0.22AB－2.57AC+1.05AD+5.11BC+1.70BD+2.57CD－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3，回歸模型系數(shù)顯著性結(jié)果見表4。

由表3方差分析結(jié)果可以看出，模型Model P=0.0004，模型達(dá)到顯著。失擬項(xiàng)Lack of Fit P=0.1950＞0.05不顯著，因此二次模型成立，應(yīng)用此模型可以分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)堿溶酸沉提取工藝的優(yōu)化。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

由表4回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng) A、B、C均顯著，D不顯著，二次項(xiàng)均顯著，交互項(xiàng)BC顯著，其他交互項(xiàng)均不顯著。影響蛋白質(zhì)提取率的因素依次為B＞A＞C＞D，即pH＞液料比＞時(shí)間＞溫度。

剔除不顯著項(xiàng)后的數(shù)學(xué)模型為:

Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2

2.3.3 文冠果蛋白質(zhì)堿溶酸沉提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖見圖 6～圖11。

圖6 液料比與pH的交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線

由圖6～圖11可知，液料比與pH之間的交互作用、液料比與提取時(shí)間之間的交互作用、液料比與提取溫度之間的交互作用、提取時(shí)間與提取溫度之間的交互作用、pH與提取溫度之間的交互作用均不顯著，僅有pH與提取時(shí)間之間的交互作用顯著。

2.3.4 提取條件的優(yōu)化［18－19］通過專業(yè)軟件分析，堿溶酸沉提取文冠果種仁蛋白質(zhì)的最佳工藝條件如表5所示。

圖7 液料比與提取時(shí)間的交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線

圖8 液料比與提取溫度的交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線

圖9 pH與提取時(shí)間的交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線

圖10 提取時(shí)間與溫度的交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線

圖11 提取溫度與pH的交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線

表5 提取率最佳的各個(gè)因素組合

由表5可知，文冠果蛋白的最佳提取工藝參數(shù)為:液料比10.59∶1(mL/g)，pH10.6，時(shí)間 73.4min，溫度41℃，在此條件下，蛋白質(zhì)提取率理論值為84.66%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行文冠果蛋白質(zhì)提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為:液料比11∶1(mL/g)，pH11，時(shí)間 73min，溫度 41℃。在此條件下提取，實(shí)際測(cè)得的平均得率為83.58%，與理論值較接近，因此，基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型的合適性。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)在研究堿溶酸沉法提取文冠果蛋白質(zhì)時(shí)各因素對(duì)提取率的影響的基礎(chǔ)上，采用了響應(yīng)面分析法對(duì)蛋白質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化堿溶酸沉提取文冠果蛋白的最佳工藝條件為:液料比 11∶1(mL/g)，pH11，時(shí)間 73min，溫度 41℃，在此條件下，文冠果蛋白質(zhì)得率可達(dá)84.66%。

3.3 在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各影響因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率作用的大小依次為:pH＞液料比＞時(shí)間＞溫度。

3.3 利用響應(yīng)面分析法得到的二次多項(xiàng)式回歸方程數(shù)學(xué)模型Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2，能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

［1］高啟明，侯江濤，李陽(yáng).文冠果的栽培利用及開發(fā)前景［J］.中國(guó)林副特產(chǎn)，2005，75(4):56－57.

［2］高述民，馬凱，杜希華，等.文冠果研究進(jìn)展［J］.植物學(xué)通報(bào)，2002(3):296－301.

［3］李占林，李銑，張鵬.文冠果化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21(6):472－475.

［4］王紅斗.文冠果的化學(xué)成分及綜合利用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)野生植物資源，1998(1):13－16.

［5］黃玉廣，喬榮群，趙軍.文冠果營(yíng)養(yǎng)及綜合加工［J］.食品研究與開發(fā)，2004，25(3):73－76.

［6］鮑純義，于守洋.脫脂文冠果種仁蛋白的營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生報(bào)，1989(1):129－132.

［7］張寒俊.堿溶酸沉法制備雙低菜子分離蛋白的工藝探討［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2005，38(5):40－43.

［8］魯子賢.蛋白質(zhì)和酶學(xué)研究方法［M］.北京:科學(xué)出版社，1988.

［9］劉寧，朱振寶，等.苦杏仁蛋白提取工藝優(yōu)化及氨基酸分析［J］.中國(guó)油脂，2008(1):26－29.

［10］鄧紅，孫俊，范雪層，等.文冠果籽油的不同提取工藝及其組成成分比較［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35(10):39－40.

［11］李招娣，鄧紅，范雪層，等.冷榨文冠果籽油的氧化穩(wěn)定性研究［J］.中國(guó)油脂，2008，33(9):34－35.

［12］鄧紅，何玲，孫俊.文冠果油的冷榨提取及理化性質(zhì)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，28(6):1028－1031.

［13］胡紗紗，汪一紅，陳娟娟，等.響應(yīng)面法優(yōu)化黃連木多糖酸提取工藝的研究［J］.食品工程，2009(1):104－108.

［14］鄒鯉嶺，李昌盛.響應(yīng)面法優(yōu)化米糠蛋白提取工藝［J］.糧食與飼料工業(yè)，2008(10):22－23.

［15］Sugarman N.Process for extraction of oiL and protein simuLtaneousLy from oiL － bearing materiaL ［P］.US Patent，2762820，1956.

［16］無錫輕工學(xué)院.食品分析［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1993.

［17］劉魁英.食品研究與數(shù)據(jù)分析［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:213－229.

［18］張鳴鏑，王章存.響應(yīng)面分析法優(yōu)化玉米胚芽蛋白的提取工藝研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2008，142(7):174－177.

［19］ABD EL－AAL M H，HAMZA M A.Invitro digestibiLity，physic－chemicaL and funditionaL properties of apricot kerneL proteins［J］.Food Chemistry，1986(19):197－211.

Study on the optimization of extraction processing for Xanthoceras sorbifoLia bunge kernel protein by alkali－solution and acid－isolation

DENG Hong，TIAN Yun－yun，TIAN Zi－qing，QIU Nong－xue，GUO Yu－rong
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

TS201.2+1

B

1002－0306(2010)08－0197－05?

2009－07－01

鄧紅(1945－)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事食品分離技術(shù)研究。

農(nóng)業(yè)部公益性項(xiàng)目(nyhyzx07－024);農(nóng)業(yè)部蘋果產(chǎn)業(yè)體系(nycytx－08)項(xiàng)目資助。