應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片從抗脫落凋亡肺癌A549細(xì)胞中篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

蘇凱 雷杰 張偉 張志培 李小飛 周勇安 張平 王小平

細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用對于細(xì)胞的某些表型具有重要意義，如果失去基質(zhì)的支持，如某些不具備轉(zhuǎn)移特性的實(shí)體瘤細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞從原位脫落進(jìn)入血流，或在體外培養(yǎng)的情況下人為阻斷細(xì)胞的粘附，細(xì)胞將發(fā)生程序性死亡，這種現(xiàn)象被稱為“anoikis”[1]，即脫落凋亡或失巢凋亡。腫瘤細(xì)胞一旦開始發(fā)生轉(zhuǎn)移，即獲得了抗脫落凋亡的能力。這種存在于某些腫瘤細(xì)胞的抗脫落凋亡，是轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生的重要原因之一[2]。目前，關(guān)于脫落凋亡/抗脫落凋亡的研究仍局限在個(gè)別基因、個(gè)別通路、抗脫落凋亡機(jī)理的認(rèn)識(shí)仍不系統(tǒng)，細(xì)胞的多樣性以及腫瘤細(xì)胞的易突變也賦予不同的腫瘤細(xì)胞不同的抗脫落凋亡機(jī)制。我們應(yīng)用高侵襲性肺腺癌A549細(xì)胞系，分別在貼壁與懸浮兩種狀態(tài)下培養(yǎng)，檢測兩種不同生長狀態(tài)肺癌A549細(xì)胞系基因表達(dá)上的差異，旨在高通量地篩選肺癌抗脫落凋亡相關(guān)基因，并從中篩選與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，為進(jìn)一步研究肺癌轉(zhuǎn)移侵襲性提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物制品公司。多聚羥乙基甲基丙烯酸樹脂（Poly-HEMA）購自Sigma公司。DNA提取試劑盒為TIANamp血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒。細(xì)胞系：高侵襲性肺腺癌A549細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生化教研室王江博士惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37oC、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[3,5]Poly-HEMA溶于無水乙醇（10 g/L）。每個(gè)55 mm直徑的petri培養(yǎng)皿加2 mL Poly-HEMA溶液，室溫下待乙醇完全揮發(fā)后，再加1遍Poly-HEMA溶液。臨用前，petri培養(yǎng)皿以PBS洗4遍，置于超凈臺(tái)中紫外線照射消毒待用。以胰酶消化貼壁的肺癌細(xì)胞，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并接種于poly-HEMA處理過的petri培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿加入1×106個(gè)細(xì)胞，置37oC、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并計(jì)數(shù)。由于Poly-HEMA不帶電荷，細(xì)胞無法貼壁，只能在培養(yǎng)皿中脫落生長，借此來模擬細(xì)胞的脫落培養(yǎng)狀態(tài)，對照組細(xì)胞為貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞質(zhì)梯度DNA測定 收集懸浮及貼壁細(xì)胞，各取1×106個(gè)。紫外燈下觀察DNA ladder[3,4]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集懸浮及貼壁細(xì)胞，各取1×106個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，然后用50 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每組分別加入PI及AnnexinV2FITC，室溫避光30 min上樣。立即用流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.2.4 芯片制備 以貼壁培養(yǎng)A549細(xì)胞為對照組，抗脫落凋亡A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，利用北京博奧生物芯片公司的人類V2.0全基因組寡核苷酸微陣列芯片（35K Human Genome Array），檢測兩種細(xì)胞的基因表達(dá)差異。

1.2.5 數(shù)據(jù)檢索 利用北京博奧生物芯片公司CB-MAS 4.0生物分子功能注釋系統(tǒng)篩選表達(dá)差異基因，利用NCBI Pubmed數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因。

2 結(jié)果

2.1 抗脫落凋亡肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng) 在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中我們觀察到，A549肺癌細(xì)胞脫落培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞開始聚集，24 h后細(xì)胞相互聚集成比較大的細(xì)胞團(tuán)塊，且培養(yǎng)時(shí)間越長，聚集成的細(xì)胞團(tuán)塊越大、越致密。但較貼壁正常生長A549細(xì)胞相比，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長速度明顯變緩，細(xì)胞形態(tài)差異明顯（圖1）。

2.2 抗脫落凋亡肺癌A549細(xì)胞檢測 收集懸浮及正常貼壁生長72 h細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)梯度DNA分析，結(jié)果顯示兩種狀態(tài)培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞電泳圖像均未出現(xiàn)凋亡特異性梯度條帶（圖2），說明細(xì)胞未發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞檢測結(jié)果與細(xì)胞質(zhì)梯度DNA 測定結(jié)果一致（圖3），兩種培養(yǎng)狀態(tài)下肺癌細(xì)胞培養(yǎng)72 h未檢測到細(xì)胞明顯凋亡（細(xì)胞凋亡發(fā)生率均小于5%）。

圖 1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（×100）A：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞； B：貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。Fig 1 Cell morphology (×100)A: suspension cultured cells; B: adherent cultured cells.

圖 2 DNA電泳Fig 2 DNA electrophoresis

圖 3 各組流式細(xì)胞凋亡率Fig 3 The percent of apoptotic cells in different groups by FCM

圖 4 基因芯片散點(diǎn)圖紅色標(biāo)記和綠色標(biāo)記的數(shù)據(jù)點(diǎn)分別表示懸浮培養(yǎng)細(xì)胞組/貼壁培養(yǎng)細(xì)胞組的Ratio值≥2和≤0.5，屬于表達(dá)有差異的基因；黑色標(biāo)記表示懸浮培養(yǎng)細(xì)胞組/貼壁培養(yǎng)細(xì)胞組的Ratio值在0.5和2之間，表達(dá)基本無差異。Fig 4 ScaTTered plot graph of Cy3-labeled and Cy5-labeled probes hybirdizing with microarrayRed and green markers represent data points marked the suspension cultured cells group/adherent cultured cells group of the Ratio value of ≥2 and ≤0.5, are there differences in gene expression; Black marker that the suspension cultured cells group/adherent cultured cells group of the Ratio value of 0.5 and the 2 between the expression of the basic no difference.

2.3 人基因表達(dá)譜芯片檢測到的表達(dá)差異基因 基因芯片檢測（圖4）共得到表達(dá)差異的基因745個(gè)（Ratio≥2.0或Ratio≤0.5），其中實(shí)驗(yàn)組相對對照組上調(diào)2倍以上的基因數(shù)目有556個(gè)，實(shí)驗(yàn)組相對對照組下調(diào)0.5倍以上的基因數(shù)目有189個(gè)。所獲得的基因通過NCBI Pubmed檢索其功能。這些表達(dá)差異基因涉及原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期蛋白、凋亡、免疫相關(guān)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白翻譯合成及一些功能未知的基因。進(jìn)一步篩選出63個(gè)與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，其中上調(diào)基因42個(gè)，下調(diào)基因21個(gè)，在上調(diào)及下調(diào)基因中，部分基因經(jīng)文獻(xiàn)檢索功能與本實(shí)驗(yàn)上下調(diào)關(guān)系不符，如上調(diào)基因?yàn)橐职┗?，下調(diào)基因?yàn)榘┗虻?，遂予以剔除，最終選定與本實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嚓P(guān)的介導(dǎo)肺癌轉(zhuǎn)移的基因38個(gè)，其中上調(diào)基因25個(gè)，下調(diào)基因13個(gè)，列于下表（表1，表2）。

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是造成各種惡性腫瘤患者死亡的主要原因，且是一個(gè)極其復(fù)雜、涉及腫瘤與宿主間相互作用的多因素過程，包括瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落，進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)與脈管內(nèi)，直至在遠(yuǎn)端適宜組織中克隆生長，期間受到許多相關(guān)基因的調(diào)控。有學(xué)者通過對肺癌、腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤細(xì)胞株體外懸浮培養(yǎng)，并通過DNA ladder和流式細(xì)胞儀進(jìn)行與相應(yīng)正常組織細(xì)胞相比，檢測均發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞的抗失巢凋亡能力明顯增強(qiáng)；同時(shí)，具有高轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株的抗脫落凋亡能力明顯強(qiáng)于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株；另外，在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，高抗脫落凋亡細(xì)胞株轉(zhuǎn)染的裸鼠全身臟器轉(zhuǎn)移率高于對照組[5-10]。這一系列試驗(yàn)驗(yàn)證了抗脫落凋亡是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的始動(dòng)環(huán)節(jié)，并提示此環(huán)節(jié)是受到相關(guān)基因的嚴(yán)密調(diào)控。但是目前抗脫落凋亡的相關(guān)基因及其對腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移作用的影響并不十分清楚。因此較全面地探明腫瘤抗脫落凋亡相關(guān)基因及其對細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移功能的影響具有重要的科研和臨床價(jià)值。

鑒于腫瘤細(xì)胞的多樣性及易突變性，不同的腫瘤細(xì)胞可能存在著不同的抗失巢凋亡機(jī)制，我們選擇高侵襲性肺腺癌A549細(xì)胞系作為研究對象，首先嘗試構(gòu)建抗脫落凋亡的A549細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)證明，肺癌A549細(xì)胞可以懸浮生長不發(fā)生凋亡，但出現(xiàn)成團(tuán)塊樣生長。懸浮培養(yǎng)的A549細(xì)胞成團(tuán)塊樣生長，我們猜測可能部分代替了細(xì)胞與基質(zhì)間互相作用，使腫瘤細(xì)胞可在非生理環(huán)境下存活。然而，細(xì)胞懸浮狀態(tài)下生長緩慢，說明團(tuán)塊樣生長并不能完全代替細(xì)胞與基質(zhì)間全部生理功能，僅能維持腫瘤細(xì)胞在不利的環(huán)境下生存的最低需要。A549細(xì)胞的成功懸浮培養(yǎng)，在體外模擬了高侵襲性腫瘤細(xì)胞自原發(fā)部位侵入循環(huán)系統(tǒng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中的生存狀態(tài)，為體外實(shí)驗(yàn)研究惡性腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了很好的模型。

表 1 上調(diào)基因及其功能簡述Tab 1 The up-regulated genes and brief introdutions of their functions

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及細(xì)胞多基因的作用過程，目前的研究大都僅僅涉及個(gè)別基因，無法從全局的角度宏觀地認(rèn)識(shí)肺癌的進(jìn)展?；蛐酒瑒t具有高效、靈敏、高通量地分析細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜的優(yōu)勢。我們的研究篩選了745個(gè)表達(dá)差異基因，并將基因芯片檢查篩選出的表達(dá)差異的基因通過NCBI Pubmed進(jìn)行功能比對。結(jié)果顯示：這些表達(dá)差異基因涉及原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期蛋白、凋亡、免疫相關(guān)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白翻譯合成及一些功能未知的基因，表明腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多種基因、多類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通路并涉及多個(gè)細(xì)胞事件的復(fù)雜過程[11,12]。我們從中篩選肺癌侵襲轉(zhuǎn)移始動(dòng)環(huán)節(jié)密切相關(guān)的63個(gè)基因，但某些篩選出的基因已知功能與上調(diào)、下調(diào)比例不符，如部分抑癌基因等預(yù)期應(yīng)表達(dá)下調(diào)的基因在試驗(yàn)中表達(dá)為上調(diào)，而部分癌基因表達(dá)則為下調(diào)，雖然有某些侵襲性腫瘤確實(shí)存在某些基因會(huì)因腫瘤類型不同而部分上調(diào)，部分下調(diào)的情況，但我們目前的實(shí)驗(yàn)仍不能排除假陽性，這一部分?jǐn)?shù)據(jù)我們正在進(jìn)一步研究。而最終篩選出的38個(gè)與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，為今后系統(tǒng)的研究肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。