葛根異黃酮的分離與純化

肖芳

（錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，錫林浩特026000）

·基礎(chǔ)研究·

葛根異黃酮的分離與純化

肖芳*

（錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，錫林浩特026000）

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探討了葛根異黃酮的浸取工藝，并對(duì)大孔樹脂對(duì)葛根異黃酮純化進(jìn)行了詳細(xì)研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：浸提時(shí)，在溫度為70℃的條件下，用料液比1 g∶8 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，浸提2.5 h，葛根異黃酮浸取率最高；對(duì)6種商品化大孔樹脂吸附純化葛根異黃酮的性能進(jìn)行對(duì)比篩選，發(fā)現(xiàn)AB－8樹脂最適合葛根異黃酮的純化；洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，工作液流速為2 BV/h，浸提濃縮液pH值為5時(shí)，采用AB-8大孔吸附樹脂串聯(lián)柱對(duì)葛根異黃酮進(jìn)行純化，其效果最優(yōu)，產(chǎn)品的收率和純度都較高。

葛根；異黃酮；提取；大孔吸附樹脂；純化

AbstractTheoptimumextractingtechnologyof isoflavonoids from pueraria lobata（Wiolld.）Ohwi was investigated by using the factorial and orthogonal design, and macroreticular resin was used for the purification of pureraria isoflavonoids.The results showed that 70℃，8∶1（v/w）of 50%ethanol and 2.5 hours were the optimum ondition for the extracting of isoflavonoids from pueraria lobata（Wiolld.）Ohwi.The purification pueraria isoflavonoids with 6 commercial macro reticular resins was studied；the results showed that AB-8 was the most appropriateresinforthepurificationofpueraria isoflavonoids.With an ethanol desorption agent concentration of 70%，work solution speed of 2 BV/h and work solution pH of 5，contacted AB-8 resin column can reach a reasonable yield and purityofproduct.

KeywordsPueraria lobata（Wiolld.）Ohwi；Isoflavonoids；Extraction；Macro reticular resin；Purification

葛根（Radix Pueraria），是豆科植物葛（Puerar Lobatel（willd）.Ohwi）的塊根，含有葛根素、葛根木糖苷、大豆甙、大豆甙元等多種異黃酮類物質(zhì)，干物質(zhì)含量為50 mg/100 g，其味甘、辛、性平，既是中藥材又是營(yíng)養(yǎng)豐富的食用原料，且《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，并為中國(guó)藥典所收載。葛根中異黃酮是一種毒性極低的安全藥物，具有解肌退熱，生津止渴、降低心肌耗氧量、增加冠脈腦血管流量、緩減心絞痛、抗心肌缺血、抗心律失常、抗氧化、降低血壓、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、解毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理作用。葛根的粗提物中含多種成分，入藥時(shí)，必須對(duì)粗提物進(jìn)行選擇分離，提高異黃酮的純度。選擇性分離的一種有效方法是利用大孔樹脂吸附，大孔樹脂具有吸附性能好、吸附效率高、再生簡(jiǎn)單、解吸條件溫和、使用周期長(zhǎng)、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)。

我國(guó)湖南、廣西、江西及西南地區(qū)均有豐富的野生葛根資源，同時(shí)市場(chǎng)對(duì)葛根黃酮需求量越來(lái)越大，但我國(guó)科技投入不足，葛根異黃酮制取技術(shù)相對(duì)落后、生產(chǎn)效率低、耗能大、雜質(zhì)含量高、產(chǎn)品缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，因此，本文對(duì)葛根異黃酮提取及對(duì)粗提物進(jìn)行純化提高葛根異黃酮的純度，均有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

層析柱（上海滬西分析儀器廠）；SP-2100型紫外-可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司；KQ-1500型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；電熱數(shù)碼恒溫水浴鍋（金壇市華儀器有限公司）；RE-86旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海本波儀器有限公司）；LD5-2A離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；電子稱；烘干箱等。

1.2 材料與試劑

葛根（野生，重慶合川）；葛根素（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；AB-8大孔樹脂（南開大學(xué)）；pH試紙；乙醇；NaOH；HCl等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛根異黃酮浸提及純化工藝流程

葛根→粉碎→乙醇浸提→過(guò)濾→濃縮→乙醇沉降水溶性雜質(zhì)→濃縮→大孔樹脂吸附→蒸餾水洗脫→乙醇洗脫→收集洗脫液

1.3.2 葛根異黃酮含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)物，用紫外分光光度法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于25 mL容瓶中加體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，從中分別吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL溶液置于6個(gè)10 mL的試管中，各加乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇1 mL，用蒸餾水將體積定容至10 mL，搖勻，以第一管為對(duì)照，在250 nm處測(cè)吸光值D（λ）與葛根素含量（ρ）之間的關(guān)系作為異黃酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，該方程為D（λ）=83.4ρ－0.032，γ=0.9999，得標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

圖1 葛根異黃酮測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2.2 浸提物中總異黃酮含量的測(cè)定

將浸提溶液過(guò)濾，濾液混勻，準(zhǔn)確吸取1 mL置入100 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇至刻度，搖勻，在250 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以同樣乙醇作空白，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算葛根中異黃酮的含量。

1.3.3 AB-8型大孔樹脂預(yù)處理

將AB-8樹脂先用乙醇浸泡24 h充分溶脹，濕法裝柱。然后用95%乙醇洗至洗出液加適量水無(wú)白色混濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗盡醇，最后轉(zhuǎn)入酸堿處理：用4B體積分?jǐn)?shù)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%HCl溶液，以5 BV/h的流速通過(guò)樹脂層，并浸泡3 h，而后用蒸餾水以同樣的流速洗至流出水pH值為中性；再用4BV的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaOH溶液，以5 BV/h的流速通過(guò)樹脂層，并浸泡3 h，而后用蒸餾水以同樣的速度洗至流出水pH值呈中性。

1.3.4 葛根異黃酮的純化

將浸提的異黃酮濃縮液上柱，控制流速3 mL/min～5 mL/min，當(dāng)溶液全部吸附后，用蒸餾水洗脫至流出液為無(wú)色，然后用乙醇進(jìn)行洗脫至流出液為無(wú)色，將乙醇洗脫液收集在容器中，測(cè)其吸光度，并計(jì)算出異黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根異黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響分別用體積分?jǐn)?shù)不同的乙醇溶液對(duì)葛根浸提，

可以發(fā)現(xiàn)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，浸出物的顏色由棕黑色逐漸變?yōu)辄S褐色。結(jié)果（見表1）表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，葛根異黃酮的含量最高，浸提效果較好。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響

2.1.2 固液比對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響

在溶劑體積分?jǐn)?shù)為最佳條件時(shí)，以能浸沒(méi)樣品的最少溶劑量為基礎(chǔ)，確定最低限度固液比為1 g∶6 mL，改變固液比的試驗(yàn)結(jié)果（見表2）表明：當(dāng)固液比為1 g∶8 mL時(shí)，浸出物異黃酮含量達(dá)最高，隨著固液比減小，含量略降。

表2 固液比對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響

在確定提取溶劑濃度、固液比之后，考察提取時(shí)間對(duì)浸提效果的影響。結(jié)果（見表3）表明：浸提2 h后基本達(dá)平衡。原因可能來(lái)自兩個(gè)方面，一是生物活性成分異黃酮葛根素、大豆甙、大豆元等存在于外部的木栓層下面的外部薄層組織中，二是磨碎后的葛根粉容易被溶劑浸透，2 h后，活性物質(zhì)在固相和液相的濃度就達(dá)到了平衡。

表3 提取時(shí)間對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響

在溶劑體積分?jǐn)?shù)、固液比和提取時(shí)間都為最佳條件時(shí)，采取不同的提取溫度對(duì)葛根異黃酮進(jìn)行浸提，結(jié)果（見表4）表明：提取溫度為70℃時(shí)效果最佳。一般來(lái)說(shuō)異黃酮隨溫度升高而在乙醇中溶解度增大，因?yàn)闇囟壬弋慄S酮浸取液黏度減小，擴(kuò)散系數(shù)增大，促使浸提速度加快，浸取率提高，浸出物異黃酮含量增加；但溫度太高，會(huì)使乙醇揮發(fā)損失，致使溶劑體積分?jǐn)?shù)下降，達(dá)不到最佳效果，表4中溫度為90℃時(shí)黃酮含量明顯降低就是此原因。同時(shí)溫度太高，某些活性成分可能遭到破壞，雜質(zhì)溶出增多，操作不便，故浸提時(shí)溫度不能太高。

表4 提取溫度對(duì)葛根異黃酮浸提效果的影響

2.2 葛根異黃酮提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響葛根異黃酮浸提效果的因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)，因素水平見表5，正文試驗(yàn)結(jié)果見表6。表明，4個(gè)因素對(duì)浸出物異黃酮含量的影響與前面單因素試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致，對(duì)浸出物異黃酮含量影響主次關(guān)系順序?yàn)椋喝軇w積分?jǐn)?shù)＞固液比＞溫度＞時(shí)間；最佳的提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、固液比為1 g∶8 mL、時(shí)間為2.5 h、溫度為70℃。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表

表6 正交試驗(yàn)表

2.3 葛根異黃酮提取液的制備

經(jīng)正交試驗(yàn)，得出提取葛根異黃酮的最佳組合因素，以此組合因素對(duì)葛根進(jìn)行浸提，提取液異黃酮含量為2.34 mg/mL，將提取液濃縮至最小體積，加3～4倍體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇沉降水溶性高分子多糖、蛋白質(zhì)雜質(zhì)，經(jīng)離心去除沉淀，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得葛根異黃酮提取濃縮液，經(jīng)測(cè)定其葛根異黃酮的含量為11.93 mg/mL，備用。

2.4 葛根異黃酮的大孔樹脂純化

2.4.1 大孔吸附樹脂對(duì)葛根異黃酮的靜態(tài)吸附效果比較

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的6種大孔樹脂去除表面水后，各取2.5 g分別置于具塞磨口三角瓶中，加入異黃酮會(huì)含量為11.93 mg/mL的提取濃縮液25 mL，振蕩24 h，使樹脂充分吸附異黃酮后測(cè)定樹脂的靜態(tài)吸附效果，過(guò)濾取出吸附飽和的樹脂（得濾液1），向其中加入50 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇振蕩24 h使異黃酮解吸附，再過(guò)濾（得濾液2），分別測(cè)定濾液1和濾液2中異黃酮的含量，結(jié)果如表7。

表76 種大孔樹脂對(duì)葛根異黃酮的靜態(tài)吸附效果比較

由表7可以看出，6種樹脂對(duì)葛根異黃酮的吸附率AB-8和ADS-5l較高，分別達(dá)到26.91%和27.49%；解吸率AB-8、HPD600和ADS-17的較高，都達(dá)到了90%以上，解吸效果非常優(yōu)良；而ADS-5樹脂的解吸效果一般，只有86.82%。和有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比，本研究樹脂對(duì)異黃酮的吸附率普遍較低，其原因可能是其他研究大都利用純化的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而本研究直接以葛根異黃酮提取濃縮液為材料，提取液中的其他成分可能是造成這種差異的主要原因。綜合對(duì)比之下，AB-8樹脂對(duì)葛根異黃酮的吸附效果最好，因此，下面進(jìn)一步對(duì)AB-8樹脂對(duì)葛根異黃酮的動(dòng)態(tài)吸附進(jìn)行探討。

2.4.2 AB－8樹脂的動(dòng)態(tài)吸附及解吸附效果

選用D20 mm×L300 mm的層析柱，濕法裝柱，樹脂床體積為120 mL，料液中葛根異黃酮量為1.50 mg/mL，料液以1BV/h速度通過(guò)樹脂柱床，共處理7 BV料液，每處理1BV料液的流出液?jiǎn)为?dú)收集，測(cè)定流出液中異黃酮的含量，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看見，AB－8樹脂吸附異黃酮濃度為1.50mg/mL料液時(shí)，從第二樹脂床體積異黃酮就有很大泄漏，流出液中異黃酮濃度高達(dá)1.001 mg/mL，但樹脂床飽和吸附可達(dá)6BV。只有樹脂達(dá)到完全飽和時(shí)才能充分發(fā)揮其吸附性能，因此考慮生產(chǎn)中采用樹脂柱串聯(lián)的方法。

圖2 A B-8樹脂對(duì)葛根異黃酮的動(dòng)態(tài)吸附效果

2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB－8樹脂洗脫效果的影響

將濃縮液注入樹脂柱中，待樣品液全部通過(guò)吸附柱后，用蒸餾水洗至流出液呈澄清狀態(tài)，然后再分別用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫，將洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、真空干燥，測(cè)定異黃酮得量和純度（見表8），由表8可以看出體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗脫異黃酮收集率最高，達(dá)79.79%，而體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫后異黃酮純度最高，為34.20%，因此，本試驗(yàn)認(rèn)為采用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫可以較好地達(dá)到純化葛根異黃酮的目的。

表8 不同乙醇濃度對(duì)樹脂洗脫效果的影響

2.4.4 流速對(duì)AB-8樹脂吸附性能的影響（見表9）

表9 不同流速對(duì)AB-8樹脂吸附性能的影響

從表9可知，流速不同，異黃酮的洗脫率和收率也不同，在1 BV/h～3 BV/h內(nèi)，隨著流速的增加，異黃酮的收率隨之下降?？紤]到工作的效率和異黃酮洗脫率，選用2 BV/h流速較為適當(dāng)。

2.4.5 原液pH值對(duì)AB－8樹脂吸附性能的影響（見表10）

表10 pH值對(duì)AB-8樹脂吸附性能的影響

異黃酮類物質(zhì)屬多酚類化合物，pH影響異黃酮物質(zhì)在水中的溶解性從而影響樹脂對(duì)其吸收附性能。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葛根異黃酮原液在較低pH時(shí)，溶液呈絮狀渾濁狀態(tài)，而隨pH增加，原液逐漸澄清，并且不同pH值原液在樹脂柱中的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移速度也有明顯差異，pH值越低，其擴(kuò)散轉(zhuǎn)移速度越慢。由表10可以看出，其純度隨pH值變化的而變化，pH3時(shí)，產(chǎn)物純度最高，達(dá)48.98%；而pH5時(shí)，收率最高，達(dá)2.31%。但是試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pH值為3和4時(shí)，絮狀物在樹脂柱上部形成沉淀，對(duì)樹脂床污染和堵塞嚴(yán)重，因此認(rèn)為適宜pH值為5。

3 結(jié)論

用乙醇溶液提取葛根異黃酮時(shí)，通過(guò)四組單因素試驗(yàn)和四因素三水平正交試驗(yàn)，以及用大孔樹脂純化葛根異黃酮，通過(guò)四組單因素的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明：

a）提取葛根異黃酮時(shí)，溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、固液比為1 g∶8 mL、提取溫度為70℃、提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，浸出物中異黃酮的含量最高。

b）對(duì)6種樹脂吸附葛根異黃酮性能進(jìn)行對(duì)比篩選，發(fā)現(xiàn)AB－8樹脂最適合葛根異黃酮的純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、工作液流速為2BV/h、浸提濃縮液pH值為5時(shí)，采用AB-8大孔吸附樹脂串聯(lián)柱對(duì)葛根異黃酮進(jìn)行純化，其效果最優(yōu)，產(chǎn)品的收率和純度都較高。

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Extracting and purification ofIsoflavonoids from pueraria lobata(Wiolld.)Ohwi

XIAOFang*
（XiLinGuoLe vocational college，Xilinhaote 026000，China）

*肖芳，女，1977年出生，2003年畢業(yè)于西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程專業(yè)，講師。

2010-05-24