番茄早疫病菌抗嘧菌酯突變體培養(yǎng)特性研究

周杰敏,任璐,韓巨才,劉慧平,王文忠

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801;2.山西省平順縣北社鄉(xiāng)人民政府,山西平順 047400)

番茄早疫病Alternaria solani是由茄鏈格孢引起的番茄重要病害之一,在我國多省都有發(fā)生,對番茄產(chǎn)量影響很大。由于番茄早疫病具有潛育期短、再侵染頻繁、流行速率高的特點(diǎn),長期使用單一藥劑防治容易形成抗藥性群體[1]。嘧菌酯azoxystrobin是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑,其殺菌活性高、殺菌譜廣、內(nèi)吸性強(qiáng)、對非耙標(biāo)作物和從未使用過嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的作物安全且與環(huán)境有良好的相容性[2～4]。本文對番茄早疫病菌的抗、感菌株進(jìn)行了營養(yǎng)條件、pH及溫度的一系列生物學(xué)性狀比較,以了解抗、感菌株之間的生物學(xué)特性差異。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

番茄早疫病菌親本敏感菌株WZ42采集于山西省五寨地區(qū),經(jīng)篩選獲得。

番茄早疫病菌抗藥突變體WZ42-8,是將親本敏感菌株經(jīng)過紫外光誘導(dǎo)及藥劑馴化而獲得。

1.2 供試藥劑及培養(yǎng)基

藥劑:25%嘧菌酯(azoxystrobin)懸浮劑(先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)。

培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL。理查德培養(yǎng)基:硫酸鎂(MgSO4·7H 2O)2.50 g;氯化鐵(FeCl3)0.02 g;硝酸鉀10.00 g;磷酸二氫鉀5.00 g;蔗糖50.00 g;蒸餾水 1000 mL。

1.3 不同營養(yǎng)條件對抗性突變菌株菌絲生長的影響

供試碳源:葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖;

供試氮源:蛋白胨、牛肉膏、尿素、缺氮處理。

基本培養(yǎng)基為理查德(Richard)培養(yǎng)基[5],不同碳源相當(dāng)于理查德培養(yǎng)基中50 g蔗糖含碳量置換其中的蔗糖,不同氮源相當(dāng)于理查德培養(yǎng)基中10 g KNO3含氮量置換其中的KNO3,將含有不同碳源、氮源的培養(yǎng)基分別制成平板,每處理3皿。將抗、感菌株的4 mm菌餅接種于各處理上,在25℃恒溫箱中培養(yǎng),分別在48 h后測量菌落直徑[6],計(jì)算菌絲生長速度。

1.4 酸堿度對菌絲生長的影響

用0.1 mol·L-1的 HCl和0.1 mol·L-1的NaOH無菌操作,供試PDA培養(yǎng)基分別調(diào)整酸堿度為 p H 3、4、5、6、7、8、9、10、11 、12,每一酸度重復(fù)3次,每皿放一片4 mm的菌碟,25℃恒溫培養(yǎng),每隔24 h測一次菌落直徑,計(jì)算菌絲生長速度[7]。

1.5 溫度對菌絲生長的影響

用4 mm打孔器切取菌碟,無菌操作下移入直徑為9 cm的PDA平板中,每皿一碟,每處理重復(fù)3次,分別置于6個不同處理溫度的恒溫箱、冰箱中培養(yǎng),每隔24 h觀察一次菌落直徑,計(jì)算菌絲生長速度[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營養(yǎng)條件對抗性突變菌株菌絲生長的影響

結(jié)果(表1)表明各抗性突變體與其親本敏感菌株對碳源和氮源的利用情況有所不同:親本菌株WZ42以在可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長最快,生長速度為0.4375 mm·h-1,而抗性菌株WZ42-8在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中生長最快(其速率為0.3073 mm·h-1);親本菌株WZ42在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長最快(0.4583 mm·h-1),抗性菌株WZ42-8在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長最快(0.2951 mm·h-1)?？剐跃暝诓煌瑺I養(yǎng)源下生長速率均低于其敏感親本。其中在蔗糖、可溶性淀粉及蛋白胨培養(yǎng)基中抗、感菌株之間生長速率在5%顯著水平及1%極顯著水平上有明顯差異。

表1 不同營養(yǎng)條件下親本菌株和抗藥菌株菌絲的生長速率/mm·h-1Table1 The growing rate of isolates in different nutrition conditions/mm·h-1

2.2 酸堿度對菌絲生長的影響

研究結(jié)果(表2)表明,抗、感菌株在 p H 4～10范圍內(nèi)能生長,p H 5～7最適合菌絲生長,過酸或過堿的環(huán)境均不利于菌絲生長,而在p H＞8的條件下親本菌株與抗性突變體隨著p H的升高菌株生長的速度迅速減慢,在不同pH值條件下,親本菌株比突變體生長速度快。由表2還可以看出,在最適p H值范圍內(nèi),親本菌株在p H 6時生長最快,其菌絲生長速率為0.4467～0.6167 mm·h-1,而突變體在 p H=7時生長最快,菌絲生長速率為0.3041～0.4111 mm·h-1,可見二者生長最適pH值有所不同。在 48 h內(nèi),抗、感菌株在p H 5、6、7、8、9差異顯著。

表2 不同p H值下親本菌株和抗藥菌株菌絲的生長速率/mm·h-1Table2 The growing rate of isolates in different p H value conditions/mm·h-1

2.3 溫度對菌絲生長的影響

結(jié)果見表3,從生長速率來看,抗、感菌株的菌絲的生長速率均較穩(wěn)定,從溫度處理來看,4℃時菌絲基本不能生長,以20～25℃生長最快。在4～25℃之間隨溫度升高,兩類菌絲生長速度逐漸加快,在25～35℃范圍內(nèi)隨溫度升高,菌絲生長速率逐漸下降,35℃幾乎不生長。在25℃下,隨時間的增加抗、感菌株之間的方差分析差異逐漸減少,在120 h時差異不顯著。

表3 不同溫度下親本菌株和抗藥菌株菌絲的生長速率(mm·h-1)Table3 The growing rate of isolates in different temperature conditions(mm·h-1)

3 結(jié)論與討論

通過研究番茄早疫病菌對嘧菌酯抗、感菌株生物學(xué)特性,可以得出:敏感親本在以可溶性淀粉為碳源和以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長最快,而抗性突變體在以葡萄糖為碳源和以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中生長最快;抗性突變體在p H值為7時生長最快而親本菌株在pH值為6時生長最快;雖然不同溫度下抗、感菌株生長情況基本相似,但敏感菌株生長速率均快于抗性突變體。不同的營養(yǎng)條件、p H值、溫度對突變體菌絲生長均有影響,且不同營養(yǎng)條件及p H下,抗、感菌株之間變化明顯,說明突變體的生理特性出現(xiàn)了變異,生長發(fā)育的內(nèi)源節(jié)律發(fā)生了變化。

番茄早疫病長期以來一直以化學(xué)防治為主,使得番茄早疫病菌在一定程度上對幾種常用殺菌劑的敏感性降低[9]。盡管目前在山西省大田中尚未檢測到抗嘧菌酯的番茄早疫病菌,但已有關(guān)于番茄早疫病抗性菌株的報(bào)道[10],因此即使是嘧菌酯這類敏感性較高的藥劑在生產(chǎn)實(shí)踐中也應(yīng)該慎重使用。本研究主要對番茄早疫病菌抗嘧菌酯突變體和敏感菌進(jìn)行了一些初步的生物活性測定,在以后的研究工作中應(yīng)進(jìn)一步比較抗性突變體和敏感菌株在分子生物學(xué)和生理生化上的差異,從而對番茄早疫病菌對嘧菌酯抗性風(fēng)險(xiǎn)評估及抗性治理提供解決方案。

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