戴志紅,關(guān)孚時(shí),蔣 卉,孫海燕,李 翠,趙丹彤,關(guān)永梅,石寶蘭,張慧芳,張瑞婷,張立春,鄧 永,江 波,孟畫(huà)詩(shī),王在時(shí)*
(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081;2.金宇保靈生物藥品有限公司,內(nèi)蒙古呼和浩特010030)
豬瘟(Classical sw ine fever,CSF)是由CSF病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性豬傳染病,給世界上很多國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定通報(bào)性疫病,我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病。
我國(guó)目前實(shí)行強(qiáng)制免疫作為豬瘟防制的主要手段,因此保證疫苗質(zhì)量顯得尤為重要。鑒別檢驗(yàn)是動(dòng)物活疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)的重點(diǎn)之一,其目的是保證疫苗(菌毒種)的特異性,豬瘟兔化弱毒活疫苗也不例外?!吨腥A人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)[1]和《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2005年版3部)[2]都要求對(duì)豬瘟活疫苗(包括種毒)進(jìn)行鑒別檢驗(yàn),但由于鑒別檢驗(yàn)用陽(yáng)性血清缺乏,該工作實(shí)際并未進(jìn)行,給疫苗質(zhì)量監(jiān)管留下了隱患。為解決生產(chǎn)、檢驗(yàn)需要,本實(shí)驗(yàn)制備了豬瘟活疫苗(種毒)鑒別檢驗(yàn)陽(yáng)性血清,并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。
1.1 種毒和細(xì)胞 CSFV石門(mén)株(F114)、豬瘟兔化弱毒種毒(F480)、CSFV Thiverval株(F18)和 PK-15細(xì)胞(F145)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存。
1.2 主要試劑 豬瘟活疫苗(淋脾毒),由乾元浩生物股份公司提供;豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Idexx公司;豬瘟熒光抗體由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備;Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNasin和 RNase Free Water均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司;RNA提取試劑TRIzol Reagent和反轉(zhuǎn)錄酶SSⅢ均購(gòu)自Invitrogen公司;MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自Gibico BRL公司;48孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自CoStar公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)豬為普通健康非免疫豬,體質(zhì)量20kg左右,購(gòu)于內(nèi)蒙某豬場(chǎng),經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測(cè)為口蹄疫、豬偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病病原、抗體陰性(病原用PCR或RT-PCR方法檢測(cè),抗體用ELISA方法檢測(cè)),隔離飼養(yǎng);體質(zhì)量18g~22g小白鼠、體質(zhì)量1.5kg~2kg日本大耳白兔、體質(zhì)量350g~400g豚鼠,均為清潔級(jí),購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。
1.4 免疫原制備 按文獻(xiàn)方法[1]在強(qiáng)毒隔離動(dòng)物室制備免疫原,共獲得CSFV石門(mén)株血毒4000m L(≥105MLD/m L),-20℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.5 血清制備 在強(qiáng)毒隔離動(dòng)物室制備血清。選4頭豬,每頭豬免疫豬瘟活疫苗2頭份;14d后每頭豬肌肉注射免疫原100m L;以后每頭豬每隔10d肌肉或腹腔注射免疫原200m L~300m L,同時(shí)進(jìn)行ELISA抗體水平監(jiān)測(cè),直至抗體效價(jià)接近峰值時(shí)分別采血,分離血清。
1.6 血清過(guò)濾、分裝、凍干、熔封 將4批血清分別先經(jīng)0.4μm無(wú)菌濾膜加壓過(guò)濾,再經(jīng)0.22μm無(wú)菌濾膜加壓過(guò)濾;隨后用瓶頸分液器(分裝精度為±0.01m L)無(wú)菌分裝至1m L滅菌長(zhǎng)安瓿,分裝過(guò)程中用攪拌子保持低速攪拌;按常規(guī)方法凍干后抽真空、熔封。
1.7 成品檢驗(yàn)
1.7.1物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、真空度測(cè)定4批產(chǎn)品均隨機(jī)抽取規(guī)定數(shù)量的樣品,按文獻(xiàn)方法[1]和[2]進(jìn)行。
1.7.2剩余水分測(cè)定采用真空干燥法[1]。
1.7.3均一性檢驗(yàn)每批隨機(jī)抽取20支樣品,隨機(jī)分為2組,分別進(jìn)行稱重試驗(yàn)。將每支安瓿稱重后,分別仔細(xì)收集玻璃殘?jiān)?;將安瓿?nèi)容物溶解后用去離子水沖洗干凈,烘干,連同各自的玻璃殘?jiān)謩e稱重;再用安瓿打開(kāi)前的總重量減去該重量,即可計(jì)算凍干血清的重量。用狄克遜準(zhǔn)則剔除數(shù)據(jù)中的異常值[3],再進(jìn)行t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)[3-4],即用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)兩組測(cè)定結(jié)果的平均值是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,用F檢驗(yàn)法檢驗(yàn)兩組測(cè)定結(jié)果的方差是否存在顯著性差異。若兩組測(cè)定結(jié)果的均值和方差無(wú)顯著差異,則被測(cè)樣品均一性符合要求。
1.7.4特異性檢測(cè)每批隨機(jī)抽取5支樣品,同一批次復(fù)溶混合后委托農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心進(jìn)行口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉/粘膜病毒抗體檢測(cè)(均用ELISA方法進(jìn)行)。
1.7.5殘余CSFV檢測(cè)每批隨機(jī)抽取5支樣品,同一批次復(fù)溶混合后按文獻(xiàn)[5]和[6]的分別進(jìn)行免疫熒光和套式RT-PCR檢測(cè),以CSFV Thiverval株作陽(yáng)性對(duì)照,以PBS作陰性對(duì)照。
1.7.6兔體中和效價(jià)測(cè)定將4批血清分別按照1∶400~1∶3200倍比稀釋。將豬瘟兔化弱毒種毒用滅菌生理鹽水稀釋至100兔體感染量(Rabbit infection dose,RID)/m L,與等量的稀釋血清充分混合,置10℃~15℃中和1h,其間振搖2次~3次;同時(shí)設(shè)立種毒陽(yáng)性對(duì)照(50RID/m L)、陰性對(duì)照(4批血清的所有稀釋度) 和空白對(duì)照(生理鹽水)。中和結(jié)束后,分別接種大耳白兔2只,每只耳緣靜脈接種1m L。按文獻(xiàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)[1-2]測(cè)溫。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)熱反應(yīng),而陰性對(duì)照和空白對(duì)照不出現(xiàn)熱反應(yīng),則試驗(yàn)成立。以中和后完全不引起熱反應(yīng)的血清最高稀釋度作為該血清的中和效價(jià)。
1.8 鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn) 將5種經(jīng)效力檢驗(yàn)合格的豬瘟活疫苗和豬瘟兔化弱毒種毒分別用滅菌生理鹽水稀釋至100RID/m L,與等量按各自中和效價(jià)稀釋的4批血清充分混合,置10℃~15℃中和1h,其間振搖2次~3次;同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(50RID/m L種毒和疫苗)、陰性對(duì)照(按中和效價(jià)稀釋的血清)和空白對(duì)照(生理鹽水)。中和結(jié)束后,分別接種大耳白兔2只,每只耳緣靜脈接種1m L。按文獻(xiàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)[1-2]測(cè)溫。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)熱反應(yīng),而陰性對(duì)照和空白對(duì)照不出現(xiàn)熱反應(yīng),則試驗(yàn)成立。按實(shí)際中和結(jié)果驗(yàn)證各批次血清的鑒別檢驗(yàn)效果。
2.1 物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、真空度測(cè)定 結(jié)果均符合規(guī)定。
2.2 剩余水分測(cè)定 采用真空干燥法對(duì)抽取樣品進(jìn)行了剩余水分測(cè)定,結(jié)果水分含量均低于4%(表1)。
表1 凍干血清剩余水分含量(%)Table 1The residualmoisture contents of lyophilized antisera(%)
2.3 均一性檢驗(yàn) 對(duì)4批樣品(每批2組)的稱重結(jié)果進(jìn)行了經(jīng)t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn),結(jié)果所有統(tǒng)計(jì)量t和F均小于其臨界值(表2),表明每個(gè)批次內(nèi)兩組測(cè)定結(jié)果的平均值和方差無(wú)顯著性差異,說(shuō)明4批血清樣品的均勻性良好。
2.4 特異性檢驗(yàn) 4批樣品經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測(cè),結(jié)果口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒ELISA抗體均為陰性。
2.5 殘余CSFV檢測(cè) 將樣品復(fù)溶后分別接種PK-15細(xì)胞,再進(jìn)行免疫熒光染色,結(jié)果均為陰性(圖略);將樣品復(fù)溶后進(jìn)行套式RT-PCR核算檢測(cè),結(jié)果均為陰性(圖1)。
2.6 兔體中和效價(jià)測(cè)定 4批血清倍比稀釋后分別與豬瘟兔化弱毒種毒中和,測(cè)定兔體中和效價(jià)(表3)。
表2 均一性測(cè)定結(jié)果Table 2The results of uniform ity tests
表34 批血清的兔體中和效價(jià)Table 3The neutralization titers of 4antisera tested in rabbits
2.7 鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn) 將4批血清分別按各自中和效價(jià)稀釋后,與100RID/m L的CSFV種毒和5種CSF疫苗中和后分別注射大耳白兔,進(jìn)行鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示,4批產(chǎn)品中和種毒和疫苗后,均不引起家兔產(chǎn)生熱反應(yīng)和其他異常反應(yīng)(表4),表明該4批血清能特異性中和豬瘟疫苗和種毒,可以用于其鑒別檢驗(yàn)。
鑒別檢驗(yàn)是活疫苗(包括其生產(chǎn)用菌毒種)的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目之一,其目的是保證疫苗(菌毒種)的特異性,即檢驗(yàn)疫苗(菌毒種)是否具備其應(yīng)有的免疫學(xué)或生物學(xué)特性。病毒類活疫苗(種毒)鑒別檢驗(yàn)常用的方法是檢驗(yàn)活疫苗(種毒)是否能被已知的單特異性抗體完全中和。由此可見(jiàn),鑒別檢驗(yàn)的目的和方法有別于外源病毒檢驗(yàn)或效力檢驗(yàn),其重要性不容忽視。
表4 對(duì)種毒和5種豬瘟疫苗鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4Verification of identity tests to seed virus and 5CSF vaccines
為提高血清質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)采取了以下措施:對(duì)實(shí)驗(yàn)豬和制備的血清進(jìn)行了常見(jiàn)病原、抗體檢測(cè),保證了血清的特異性;在采血前,對(duì)抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè),盡量提高血清效價(jià);在分裝前進(jìn)行了2次過(guò)濾,在分裝過(guò)程中保持低速混勻,并且進(jìn)行了均一性檢驗(yàn),保證了每批樣品的均一性;以免疫熒光和套式RT-PCR方法對(duì)血清進(jìn)行了殘余CSFV檢測(cè),提高了其生物安全性;用豬瘟兔化弱毒種毒和不同廠家生產(chǎn)的5種疫苗進(jìn)行了鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn),保證了血清的實(shí)際使用效果。
在過(guò)程中實(shí)驗(yàn)豬經(jīng)強(qiáng)毒反復(fù)攻擊,因此該血清存在殘余強(qiáng)毒的風(fēng)險(xiǎn),為此本試驗(yàn)進(jìn)行了殘余CSFV檢測(cè),結(jié)果顯示免疫熒光和套式RT-PCR檢測(cè)均為陰性。經(jīng)初步分析,以下幾點(diǎn)因素可能有助于減少血清殘余CSFV:選擇健康狀況良好的實(shí)驗(yàn)豬,基礎(chǔ)免疫劑量充足并且在抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)后開(kāi)始攻毒;我國(guó)馴化發(fā)明的豬瘟兔化弱毒疫苗本身非常優(yōu)異,該疫苗免疫不僅能誘導(dǎo)完全的臨床保護(hù)(不發(fā)病),而且能產(chǎn)生完全的“病毒學(xué)”保護(hù)(不出現(xiàn)病毒血癥,不排毒)[7];采血時(shí)機(jī)的把握,一般在監(jiān)測(cè)到抗體峰值后一周內(nèi)采血為宜。即便如此,仍不能完全排除血清殘余CSFV的可能性,因此仍有必要進(jìn)行嚴(yán)格的CSFV檢測(cè),一旦CSFV檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性,則應(yīng)該用鈷60射線照射處理,但會(huì)顯著降低抗體效價(jià)。
另外,由于易受動(dòng)物個(gè)體差異、環(huán)境和人為操作等影響,在生產(chǎn)實(shí)際中用兔體反應(yīng)測(cè)定豬瘟兔化弱毒含量可能存在較大誤差,因此在使用該血清進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)可以參照標(biāo)定的中和效價(jià),根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)降低血清稀釋度進(jìn)行中和試驗(yàn),確保血清能將兔化弱毒完全中和。
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