高脂飲食豚鼠高密度脂蛋白代謝的特點

陳慧敏，高南南，楊潤梅，李金蓮

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所藥理毒理研究中心，北京 100193)

研究報告

高脂飲食豚鼠高密度脂蛋白代謝的特點

陳慧敏，高南南，楊潤梅，李金蓮

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所藥理毒理研究中心，北京 100193)

目的研究豚鼠高脂飲食后高密度脂蛋白代謝的特點，并與大鼠進行比較。方法將豚鼠和大鼠分別隨機分為正常組(NC)和高脂組(HF)，正常組均給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料誘導10周后，測定血清LDL－C、HDL－C水平，HDL3/HDL2比值和LCAT、CETP的表達;采用real－time RT－PCR方法檢測肝臟SR－BI表達的變化。結果與正常組相比，豚鼠高脂組血清HDL－C水平顯著升高，高密度脂蛋白亞型HDL3/HDL2的比值升高，血清CETP表達均顯著增加，血清LCAT表達下降，肝臟SR－BI mRNA表達水平是正常組的2.27倍。而相同高脂飼料條件下，大鼠的上述指標均無明顯變化。結論豚鼠攝入高脂飲食后HDL代謝與大鼠有所不同，主要表現(xiàn)為血清HDL－C升高，肝臟SR－BI受體表達增加，高密度脂蛋白亞型組分發(fā)生變化，大顆粒HDL2含量相對減少，小顆粒HDL3堆積，其機制與血清CETP、LCAT的變化密切相關。

豚鼠;高密度脂蛋白亞型;卵磷脂膽固醇?；D移酶;膽固醇酯轉移蛋白;B族Ⅰ型清道夫受體

圖1 豚鼠SR-BI 基因擴增產物溶解曲線Fig.1The dissociation curves of the guinea Pig SR-BI gene PCR Products

豚鼠的脂代謝生理特征、對飲食性膽固醇和藥物治療的反應性等方面都與人類存在許多相似之處，是一種比較理想的研究高脂血癥和動脈粥樣硬化的模型動物［1－4］。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，通過高膽固醇高脂肪飲食誘導豚鼠形成典型的高脂血癥和動脈粥樣硬化病變時，其血漿高密度脂蛋白－膽固醇(HDL－C)水平也明顯升高［4］，這一點與大鼠等動物的HDL－C變化有所不同。

高密度脂蛋白(HDL)是顆粒大小、組成和功能不均一的一類脂蛋白，其亞型HDL2和HDL3的相對含量、顆粒大小與高脂血癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關［5］。膽固醇酯轉移蛋白(CETP)、卵磷脂膽固醇?；D移酶(LCAT)和B類I型清道夫受體(SRBI)與HDL的代謝密切相關。本文采用高脂飼料誘導豚鼠形成脂代謝紊亂病變，檢測血清LDL－C、HDLC水平、HDL亞型HDL3/HDL2比值及與其代謝相關的酶和受體的變化，同時與大鼠模型進行比較，探討豚鼠HDL代謝特點及影響機制。

1 材料和方法

1.1 動物

雄性Hartley豚鼠，體重230～250 g，來源于北京科宇動物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2007－0003】。雄性Wistar大鼠，體重210～230 g，來源于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所【SCXK(京)2008－0013】。

1.2 飼料

高脂飼料配方:0.5%膽固醇、10%豬油，89.5%基礎飼料。高脂飼料和常規(guī)飼料均由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所營養(yǎng)部提供及加工制作【SCXK (京)2006－0003】。

1.3 主要試劑及儀器

直接低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)，批號: 090221;直接高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)，批號: 090291，均為中生北控生物科技股份有限公司產品。大鼠和豚鼠膽固醇酯轉移蛋白(CETP)、卵磷脂膽固醇?；D移酶(LCAT)、高密度脂蛋白2(HDL2)和高密度脂蛋白3(HDL3)酶聯(lián)免疫試劑盒，由上海朗頓生物科技有限公司提供(ADL)。TRIzol○Rreagent， Invitrogen(USA);反轉錄試劑盒:PrimeScriptTMRT reagent Kit，TakaRa(Japan);PCR試劑盒:SYBR○RPremix Ex TaqTM，TakaRa(Japan)。7060型全自動生化分析儀，日本日立公司;凝膠成像儀:Gel Doc XR and ChemiDoc XRS systems，Bio－RAD(USA);熒光定量PCR儀:Bio－RAD IQ5 multicolor real－time PCR detection system(USA)。

1.4 方法

上述動物適應性喂養(yǎng)一周后，將豚鼠和大鼠分別隨機分為正常(NC)和高脂模型組(HF)，每組10只。正常對照組飼常規(guī)飼料，高脂模型組飼高脂飼料。連續(xù)飼養(yǎng)10周后股動脈取血，離心分離血清，按試劑盒說明操作，酶法測定血清LDL－C、HDL－C水平，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清HDL2、HDL3、LCAT和CETP含量。取血后脫頸處死，解剖取肝臟，－80℃保存，用于檢測肝臟SR－BI基因表達的變化。

1.4.1 豚鼠SR－BI引物設計:根據(jù)GenBank中已發(fā)表的人類(NM005505)、日本大耳兔(NM001082788)、大鼠(NM031541)和小鼠(NM016741)的基因序列，運用同源性分析軟件MGEA進行序列比對分析，在不同的外顯子上設計豚鼠SR－BI基因的引物。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.4.2 Real－time PCR:用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA，按反轉錄試劑盒說明書反轉成單鏈cDNA，進行實時定量PCR分析。Real－time PCR反應體系按照PCR試劑盒配置，PCR的引物序列、擴增片段長度和退火溫度見表1。PCR反應條件如: 95℃預變性30 s;95℃變性5 s;退57℃(依引物而定)30 s;40個循環(huán)。擴增結束后，將PCR產物以0.5℃/s程序性升溫至95℃，實時熒光定量PCR儀自動繪制溶解曲線。選取任意cDNA樣本制作各檢測基因的標準曲線，判斷擴增效率。

表1 PCR引物序列及參數(shù)Tab.1The sequences and parameters of the PCR primers

1.5 數(shù)據(jù)處理

血清LDL－C、HDL－C、HDL3/HDL2比值、LCAT和CETP的實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計，以平均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，顯著水平為P＜0.05。基因表達的數(shù)據(jù)使用基因表達相對定量軟件REST?進行數(shù)據(jù)分析［6］，顯著水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 血清LDL-C、HDL-C水平和HDL3/HDL2比值

高脂飼料誘導10周后豚鼠血清LDL－C水平顯著升高(P＜0.01)，與正常組比較升高7.80倍;大鼠LDL－C水平較正常組升高1.48倍(P＜0.05)。豚鼠高脂組血清HDL－C水平亦顯著性升高(P＜0.01)，是正常組10.75倍，進一步對HDL的亞型組成進行測定，豚鼠高脂組HDL3/HDL2比值為(4.48 ±0.70)，較對照組(HDL3/HDL2=3.82±0.31)明顯升高(P＜0.05)。相同高脂飼料誘導的大鼠血清HDL－C水平及高密度脂蛋白亞型HDL3/HDL2比值均無明顯變化(表2)。

表2 豚鼠血清LDL－C、HDL－C、CETP、LCAT含量和HDL3/HDL2比值的變化(ˉx±s)Tab.2Changes of serum LDL－C，HDL－C，CETP，LCAT concentrations and HDL3/HDL2ratio in the guinea pigs(ˉx±s)

2.2 血清CETP和LCAT的表達

與正常組比較，豚鼠高脂組血清CETP含量顯著升高(P＜0.01)，LCAT含量下降(P＜0.05);大鼠高脂組血清CETP和LCAT的含量較正常組均無明顯變化(表2)。

2.3 肝臟SR-BI的表達

2.3.1 豚鼠SR－BI基因擴增特異性:SYBR I熒光染料的實時定量反應的特異性是通過分析PCR產物的溶解曲線來實現(xiàn)的。實驗結果表明，豚鼠SRBI引物能在50℃退火時能特異的擴增出Tm約為87.0℃(預測Tm為87.0℃)的單一產物(圖1，彩插4)，且擴增產物的溶解曲線為單一主峰，說明無引物二聚體和非特異性擴增。同時，瓊脂糖電泳上可清晰看到單一的擴增條帶，長約143 bp(圖2)。

2.3.2 肝臟SR－BI mRNA表達變化:通過real－time PCR進行SR－BI mRNA的相對表達分析，高脂組豚鼠肝臟SR－BI mRNA表達水平顯著升高(P＜0.01)，是正常組的2.27倍，而相同高脂飲食大鼠肝臟的SR－BI mRNA表達與正常組無明顯變化(圖3)。

3 討論

圖2 豚鼠SR－BI基因PCR擴增產物瓊脂糖電泳圖譜Fig.2PCR products of the guinea pig SR－BI cDNA

實驗結果表明，豚鼠正常組血清LDL－C水平較HDL－C高，具有較高的LDL－C/HDL－C比例(LDL－C/ HDL－C=2.8)，說明豚鼠血漿膽固醇主要通過LDL進行轉運，這一點與人極為相似［1］。而大鼠正常組LDL－C/HDL－C比值僅為0.23，說明其膽固醇主要是由HDL攜帶轉運。豚鼠經高脂飼料誘導后，除血清LDL－C明顯升高外，HDL－C水平也明顯升高，而大鼠經相同高脂飼料誘導后，血清LDL－C升高，但HDL－C變化則不明顯。說明兩種動物攝入外源性膽固醇后，其HDL－C的變化是不同的，這主要是由于它們的血漿脂蛋白的構成、對膽固醇反應的生理機制有所不同。豚鼠血清HDL－C明顯升高，可能是為了清除血清過多的膽固醇酯，而對高膽固醇膳食的一種代償性反應。而大鼠HDL－C變化不明顯，可能是已具有HDL－C/LDL－C高比值水平(HDL－C/ LDL－C=3.35)，對外源性膽固醇未出現(xiàn)HDL－C代償性升高反應。

注:與正常組相比，**P＜0.01圖3豚鼠和大鼠肝臟SR－BI基因的相對表達Note:Compared with the control group，**P＜0.01Fig.3 Relative SR－BI mRNA expression in the liver of the guinea pigs and rats

B類Ⅰ型清道夫受體(SR－BI)是高密度脂蛋白代謝的受體，主要表達于肝臟和類固醇源性組織等，能介導膽固醇的選擇性吸收［7］。本研究根據(jù)人、兔、大鼠等物種的SR－BI基因序列，設計豚鼠SR－BI基因表達的引物，首次證實了豚鼠肝臟存在SR－BI基因，同時對高脂飼料誘導下兩種嚙齒類動物肝臟SR－BI的變化進行了初步的研究。結果表明，大鼠和豚鼠給予相同的高脂飼料后肝臟SR－BI的變化不相同，豚鼠肝臟SR－BI基因表達增加，而大鼠變化則不明顯。豚鼠肝臟SR－BI表達增加的原因是豚鼠在高脂飼料誘導下，血清HDL－C水平明顯升高，由此刺激了肝臟SR－BI表達增加。相比而言，大鼠的血漿脂蛋白構成以HDL為主，大部分的膽固醇是由HDL攜帶經肝臟SR－BI代謝［8］，因此大鼠肝臟SRBI對HDL代謝能力較豚鼠和人類強。當大鼠攝入高脂飼料后，SR－BI對攜帶有外源性膽固醇的HDL能完全代謝，因此其血清HDL－C水平及肝臟SR－BI表達均未出現(xiàn)明顯變化。

高密度脂蛋白可分為兩個大的亞型，即大顆粒的HDL2(1.063～1.125 kg/L)和小顆粒的HDL31.125～1.210 kg/L)。HDL3含有少量的apoA－I和極性脂質，主要介導細胞膽固醇的流出，HDL2含有較多的apoA－I和膽固醇酯，與細胞膽固醇的酯化、轉運及清除有關。新生的HDL作為膽固醇的接受體可介導外周組織多余的膽固醇流出，在卵磷脂膽固醇?；D移酶(LCAT)的酯化下依次形成小顆粒HDL3和大顆粒HDL2，HDL2所含的膽固醇酯可經SR－BI受體選擇性攝入肝臟代謝。當小顆粒的HDL3轉變成大顆粒HDL2受阻時，外周膽固醇則不能有效的轉運至肝臟進行代謝。因此，高密度脂蛋白亞型組成分析比單純的HDL－C含量的變化更能說明高密度脂蛋白代謝的真實狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠和豚鼠經高脂飼料誘導后高密度脂蛋白亞型的組成發(fā)生了不同的變化。豚鼠的HDL3/HDL2比值增大，說明豚鼠血清HDL顆粒呈現(xiàn)出變小的趨勢，大顆粒的HDL2含量相對下降，小顆粒的HDL3堆積，HDL攜帶外周膽固醇至肝臟代謝的能力減弱。與豚鼠不同，大鼠經高脂飼料誘導后高密度脂蛋白亞型HDL3/HDL2比值與對照組比較無明顯改變。豚鼠高脂組血清HDL亞型組成的變化與HDL代謝的相關酶的活性變化有關。

LCAT的主要作用是催化HDL的游離膽固醇酯化，促使HDL由pre β－HDL、HDL3向HDL2的轉變和成熟［9］。LCAT活性的變化將導致高密度脂蛋白亞型組成發(fā)生變化，當LCAT活性下降時，小顆粒的HDL3含量明顯增加，而大顆粒的HDL2含量明顯減少。本實驗中豚鼠高脂組血清LCAT的含量下降，其催化HDL膽固醇酯化的速率降低，導致HDL成熟過程受阻，血中小顆粒的HDL3堆積，而大顆粒的HDL2的含量相對減少，可能是豚鼠HDL3/HDL2比值升高的原因之一。

文獻報道，豚鼠血漿膽固醇酯轉移蛋白(CETP)轉運活性相當于人類的49%，而大鼠僅為人類的14%［10］。本實驗中豚鼠正常組較大鼠正常組的CETP含量高，與文獻報道一致。高CETP活性的動物(如豚鼠和人)大部分的HDL－C是通過CETP進行脂交換，而低CETP活性的動物(如大鼠)，HDL－C主要通過SR－BI直接代謝［8］。CETP可將HDL2中的膽固醇酯轉移至極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)，并將VLDL和LDL中的甘油三酯(TG)轉運至HDL2，這種富含TG的HDL2極易被肝脂酶(HL)識別并分解，使大顆粒的HDL2轉變?yōu)樾☆w粒的HDL3，造成HDL2含量相對減少，而HDL3堆積［11］。豚鼠高脂組血清CETP含量顯著增加，促進了HDL2向HDL3轉變，導致血中大顆粒的HDL2水平相對降低，從而改變了血清HDL亞型的組成，因此高含量CETP是造成豚鼠HDL3/HDL2比值增加的另一機制。

本實驗通過與大鼠比較，研究了豚鼠高脂飲食誘導后HDL代謝的特點。其結果表明，豚鼠經高脂飲食后血清HDL－C升高，肝臟HDL的受體SR－BI表達增加，HDL亞型HDL3/HDL2升高，表現(xiàn)為大顆粒HDL2含量減少，而小顆粒的HDL3堆積，與大鼠存在明顯的區(qū)別，其機制與血清CETP、LCAT的變化密切相關。我們的研究結果為豚鼠、大鼠兩種嚙齒類動物經高脂膳食誘導后高密度脂蛋白的變化及其機制的闡明提供了一定的科學依據(jù)，也為豚鼠高脂血癥及動脈粥樣硬化模型應用于人類HDL代謝和相關藥物的研究提供了一定的參考。

(本文圖1見彩插4。)

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Characteristics of High Density Lipoprotein Metabolism in High Fat Diet-Fed Guinea Pigs

CHEN Hui－min，GAO Nan－nan，YANG Run－mei，LI Jin－lian

(Research Center for Pharmacology and Toxicology，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

ObjectiveTo study the characteristics of high density lipoprotein metabolism in guinea pigs fed with high fat diet，and compared with that in rats.MethodsHealthy adult male guinea pigs and rats were randomly divided into normal control groups(NC)and high－fat groups(HF)(n=10)，10 animals each，respectively.The NC groups were fed with normal forage，while the HF groups were given high fat diet(common forage plus 0.5%cholesterol and 10%lard)for 10 weeks.Blood samples were collected and the serum LDL－C，HDL－C levels，HDL3/HDL2ratio and CETP，LCAT concentrations were measured.The the hepatic relative expression of SR－BI mRNA was detected by real－time PCR.ResultsCompared with the control group，the serum HDL－C level，HDL3/HDL2ratio and CETP concentration in the guinea pigs of high－fat group were elevated significantly，LCAT was decreased(P＜0.05)，and the relative expression of hepatic SR－BI mRNA was 2.27 times high as that of the control group(P＜0.01).However，there were no significant differences between those indexes in the rats of control and high－fat groups.ConlusionThere are distinct differences in HDL metabolism between guinea pigs and rats when fed with high－fat diet.The serum HDL－C level and the expression of hepatic SR－BI are increased，the HDL subclasses are changed with a relative decrease of large－sized HDL2particles and accumulation of smallsized HDL3in the guinea pig，and its mechanisms are closely related to the changes of serum CETP and LCAT concentration.

Guinea pig;SR－BI;HDL subclasses;LCAT;CETP

R589.2

A

1005－4847(2010)03－0199－05

2009－10－12

科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項—綜合性新藥研究開發(fā)技術大平臺—創(chuàng)新藥物研究開發(fā)技術平臺建設(2009ZX09301－003)。

陳慧敏，女，碩士研究生，研究方向:中藥藥理學。

高南南，女，教授，研究方向:中藥藥理學。E－mail:gaonann@126.com