低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2結(jié)合蛋白在心臟特異轉(zhuǎn)基因小鼠中引起的心臟功能代償

張麗，全雄志，董偉，王書美，張曉娟，葛文平，高珊，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2結(jié)合蛋白在心臟特異轉(zhuǎn)基因小鼠中引起的心臟功能代償

張麗，全雄志，董偉，王書美，張曉娟，葛文平，高珊，張連峰*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的建立心臟特異表達(dá)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2結(jié)合蛋白(Lrp2bp)轉(zhuǎn)基因小鼠，研究該基因在心肌病發(fā)病中的作用。方法克隆鼠源Lrp2bp基因入α－MHC啟動(dòng)子下游，構(gòu)建a－MHC－Lrp2bp表達(dá)載體，顯微注射法建立Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定轉(zhuǎn)基因首建鼠的基因型。Western blotting鑒定Lrp2bp在心臟中的表達(dá)，心臟超聲檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠及野生型小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果得到了4個(gè)Lrp2bp轉(zhuǎn)基因品系，其中3個(gè)品系心臟Lrp2bp蛋白表達(dá)量與同齡野生型鼠相比明顯增加。1 M齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩陰性對(duì)照小鼠相比，心壁變厚，心腔變大，射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率下降。結(jié)論心臟特異表達(dá)的Lrp2bp基因能引起心肌肥厚表型，可能是參與心肌代償性肥厚的基因之一。

Lrp2bp;轉(zhuǎn)基因小鼠;心臟;代償

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2結(jié)合蛋白(LDL receptor－related protein 2 binding protein，Lrp2bp)，又稱兆蛋白結(jié)合蛋白，是一種新型的具有四肽重復(fù)序列的支架蛋白，功能尚不明確，可能作為接頭分子，通過與兆蛋白結(jié)合，捕捉和釋放轉(zhuǎn)錄因子，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［1］。

本實(shí)驗(yàn)室建立的cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠心臟變大，室壁變厚，心腔變小，心肌細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)纖維化，心肌舒張功能失調(diào)［2］;cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠全心擴(kuò)大，室壁變薄，間質(zhì)纖維化，心肌收縮功能失調(diào)［3，4］。兩者分別表現(xiàn)出典型的肥厚型和擴(kuò)張型心肌病病理表型。兩種疾病模型動(dòng)物心臟基因表達(dá)芯片結(jié)果顯示，Lrp2bp在擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物模型心肌中mRNA顯著上調(diào)表達(dá)，而在肥厚型心肌病動(dòng)物模型心肌中表達(dá)較少，Lrp2bp可能參與心肌病發(fā)生發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

α－MHC Clone 26載體來自Baylor Medical College，Schinider Lab。Trizol提取液、Superscript. First－Strand Synthesis System for RT－PCR均購自Invitrogen。QIA quickGel Extraction Kit Protocol購自QIAGEN(德國)。限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I購自TaKaRa公司(日本)。所有引物由上海生工公司合成。測(cè)序由北京諾賽基因公司完成。Lrp2bp多克隆抗體、Western Blotting化學(xué)發(fā)光試劑為Santa Cruz公司(美國)產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋。HRP－GAPDH內(nèi)參購自上?？党?。C57BL/6J和ICR小鼠購自北京康藍(lán)生物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2004－0001］。顯微注射儀為Nikon TE2000－U，倒置顯微鏡為Olympus(日本)產(chǎn)品。Vevo770小動(dòng)物超聲探測(cè)系統(tǒng)購自加拿大VisualSonics公司。

1.2 RT-PCR

Trizol法提取小鼠心臟總RNA，用Superscript III reverse transcriptase試劑盒的方法將2 μg RNA用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈?？缤怙@子設(shè)計(jì)Lrp2bp基因片段PCR引物，以1 μL cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR，上游引物為:5’－CTATTTTGAAGAGGGCTGGT－3’，下游引物為:5’－AATGCCAGAAAAATGCCTT－3’。PCR反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 m in，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，24個(gè)循環(huán)。瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，目的基因Lrp2bp片段為392 bp。

1.3 L rp2bp表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

提取小鼠心臟總RNA，用RT－PCR擴(kuò)增小鼠Lrp2bp全長(zhǎng)cDNA，將擴(kuò)增片段插入pMD18T載體，經(jīng)測(cè)序并比對(duì)正確無突變堿基后，以Sal I酶切回收Lrp2bp片段，并克隆入α－MHC啟動(dòng)子下游構(gòu)建心臟特異Lrp2bp表達(dá)載體，用Not I將其線性化，Sephedex G50柱純化DNA片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段的濃度調(diào)整至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠［5］。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(GC－08－2032)。

1.4 PCR鑒定L rp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［6］，用PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)。引物及反應(yīng)條件和RT－PCR相同，30個(gè)循環(huán)。

1.5 W estern blotting鑒定L rp2bp蛋白的表達(dá)

提取F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠及同窩陰性小鼠的心臟總蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到0.45 μm硝酸纖維素膜上，置于5%的脫脂奶粉封閉液中，室溫1 h，加入TBST稀釋的的兔抗Lrp2bp多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過夜，用TBST洗膜三次，每次10 m in。然后加入1∶15 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫雜交1 h。采用HRP－GAPDH作為內(nèi)參，棄去二抗，TBST洗膜三次，每次5 min，TBS洗膜一次，10 m in。將膜置于化學(xué)發(fā)光劑中，用X線膠片曝光。

1.6 超聲檢查L(zhǎng)rp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠

選用不同月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，飽和三溴乙醇麻醉，選用30 Hz的探頭，進(jìn)行心臟超聲影像分析［7］。

1.7 電鏡超微結(jié)構(gòu)

取部分左心室心臟組織固定于2.5%戊二醛(PBS，pH 7.4)固定液中，1%鋨酸固定1 h，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂Epon 812包埋。乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后在透射電鏡下觀察，數(shù)碼相機(jī)拍攝圖片。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果

本室3月齡cTnTR92Q和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心臟總RNA的全基因表達(dá)芯片(Mouse Expression Array430 sets)，結(jié)果顯示，Lrp2bp在兩種轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中表達(dá)差異較大，故采用RT－PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證(圖1)。

2.2 L rp2bp基因在野生小鼠組織的表達(dá)譜

提取一月齡野生小鼠心、肝、脾、肺、腎和腦六種組織總蛋白，Western blotting分析Lrp2bp在各組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，Lrp2bp主要在成年小鼠腎臟組織中表達(dá)，肝、脾中表達(dá)較高，心、肺和腦組織中表達(dá)量少(圖2)。

2.3 L rp2bp表達(dá)載體的構(gòu)建

用RT－PCR法克隆的Lrp2bp基因，測(cè)序結(jié)果表明克隆的cDNA同已報(bào)道Lrp2bp序列完全一致(GenBank No.NM_026278)，將Lrp2bp基因插入心臟特異表達(dá)的α－MHC啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建Lrp2bp轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體(圖3)。

2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA，用PCR檢測(cè)Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠(圖4)，共得到4只首建鼠，均可傳代。

圖2 Lrp2bp在1月齡野生小鼠不同組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of Lrp2bp gene in different tissues of wild type mice aged 1 month

圖3 αMHC－Lrp2bp表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.3 The construction of αMHC－Lrp2bp vector

2.5 L rp2bp基因在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)

提取4個(gè)首建鼠一月齡F1代轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠心臟組織總蛋白，用Western blotting分析Lrp2bp基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，Lrp2bp基因在1、3和6三個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的心臟組織中高表達(dá)(圖5)。

注:P:以轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒為模板的陽性對(duì)照;N:陰性對(duì)照;H2O:空白對(duì)照;M:DL2000 DNA分子量標(biāo)記;1～7:為轉(zhuǎn)基因鼠的DNA樣品。圖4轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定Note:P is αMHC－Lrp2bp p lasmid used as positive control;N is the negative control;H2O is water as the blank control;M is DL2000 DNA marker;1－7 are genomic DNA samples from the transgenic mice.Fig.4 Genotyping of the transgenic mice by PCR

2.6 超聲檢查

注:WT是野生型對(duì)照，Tg 1、Tg 3、Tg 6和Tg 7是4個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性品系。圖5 Lrp2bp基因在首建鼠F1代小鼠心臟中的表達(dá)Note:WT is wild type mice control;Tg 1，3，6 and 7 a re the trangenic lines.Fig.5 The expression of Lrp2bp gene in the heart of transgenic mice

1、3月齡Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠進(jìn)行心臟超聲影像分析(表1)，結(jié)果顯示，1月齡Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠收縮期和舒張期左室前壁厚度(LVAW)分別增加20%和14%。收縮期左室內(nèi)徑(LVID，systolic)增加16%，舒張期左室內(nèi)徑(LVID，diastolic)增加9%，射血分?jǐn)?shù)(EF%)和短軸縮短率(FS%)分別降低8%和10%;3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟收縮期左室前壁厚度增加16%，舒張期左室前壁厚度增加22%，其他監(jiān)測(cè)指標(biāo)與野生對(duì)照小鼠相比無顯著差異。

上述數(shù)據(jù)表明，Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠出生后即心腔擴(kuò)大，心壁變厚，心功能下降，但是隨月齡增長(zhǎng)，病理表型逐漸消失。表明Lrp2bp基因表達(dá)對(duì)心臟發(fā)育及心肌病發(fā)生發(fā)展起到一定的調(diào)節(jié)作用。

表1 1、3月齡Lrp2bp和野生型小鼠M超聲參數(shù)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(±s)Tab.1 Independent samples T test of wild type and Lrp2bp transgenic mice aged 1 and 3 months(±s)

表1 1、3月齡Lrp2bp和野生型小鼠M超聲參數(shù)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(±s)Tab.1 Independent samples T test of wild type and Lrp2bp transgenic mice aged 1 and 3 months(±s)

注:*P＜0.05，**P＜0.01;野生型，n=16;Lrp2bp轉(zhuǎn)基因，n=18.Note:*P＜0.05，**P＜0.01;W ild type，n=16;Lrp2bp tg mice，n=18.

年齡(月) Age (month)組別Group收縮期左室前壁LVAW，s (mm)舒張期左室前壁LVAW，d (mm)收縮末期左室內(nèi)徑LVESD (mm)舒張末期左室內(nèi)徑LVEDD (mm)射血分?jǐn)?shù)(%) EF (%)短軸內(nèi)徑縮短率(%) FS(%) 1月齡One month野生型Wild type 1.02±0.1 0.63±0.1 1.93±0.3 3.25±0.2 76.17±5.1 44.10±4.9轉(zhuǎn)基因Lrp2bp tg 1.23±0.1**0.77±0.1**2.24±0.3**3.54±0.2**70.06±7.8*39.27±6.3*3月齡Three months野生型W ild type 1.05±0.1 0.68±0.06 2.65±0.3 3.84±0.3 62.46±6.2 33.38±4.5轉(zhuǎn)基因Lrp2bp tg 1.25±0.3*0.83±0.10*2.65±0.6 3.84±0.3 64.26±14.1 35.63±10.9

2.7 電鏡超微結(jié)構(gòu)

6月齡小鼠心臟的透射電鏡顯示，野生小鼠的心肌纖維排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰;而Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌纖維肌小節(jié)變長(zhǎng)，Z帶變窄，肌漿網(wǎng)輕度擴(kuò)張(圖6)。

注:A，野生鼠;B，Lrp2bp轉(zhuǎn)基因鼠。肌小節(jié)長(zhǎng)度(雙向箭頭)，肌漿網(wǎng)(箭頭)，線粒體(白色星星)。圖6 6月齡小鼠左心室電鏡圖Note:A:W ild type mice.B:Lrp2bp tg mice.The double headed arrow indicates sarcomere length.The arrowhead indicates sarcoplasmic reticulum.The white star indicates mitochondria.Fig.6 Respresentative transmission electron micrographs of the cardiomyocytes in the left ventricle wall from mice aged 6 months

3 討論

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2(LDL receptorrelated protein 2，Lrp2)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞表面蛋白，屬于一種內(nèi)吞性受體，是低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)基因家族七大成員之一。Lrp2除了參與內(nèi)吞作用外，還具有細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能。Lrp2bp作為與Lrp2結(jié)合的一種新型接頭分子，可能通過與受體相互作用，招募各種蛋白分子形成蛋白復(fù)合體，介導(dǎo)受體參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)揭示，與Lrp2bp結(jié)合的蛋白分子可以分為兩大類:轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子如ski作用蛋白(SKI－interacting protein)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分包括蛋白激酶Cα結(jié)合蛋白(PRKCABP)和促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)等。然而，Lrp2和Lrp2bp相互作用的分子機(jī)制及參與的具體生理過程還有待于闡明［1］。

人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2結(jié)合蛋白在各種組織和器官中廣泛表達(dá)，在人子宮、睪丸、小腸、結(jié)腸、血液白細(xì)胞及人胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平較高［8，9］。本研究中Lrp2bp基因小鼠組織表達(dá)譜顯示，Lrp2bp主要在成年小鼠腎臟中表達(dá)，在心臟中也有少量表達(dá)。mRNA水平上，Lrp2bp在擴(kuò)張型心肌病模型小鼠心臟中表達(dá)較高，提示Lrp2bp在心臟發(fā)育及心肌病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

目前關(guān)于Lrp2bp基因功能的研究較少，更沒有和心肌病之間聯(lián)系的相關(guān)報(bào)道。本研究建立的Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠心臟功能及幾何構(gòu)型與野生型小鼠相比發(fā)生了顯著變化，表明Lrp2bp基因的表達(dá)可能在心肌病發(fā)生發(fā)展中起到一定的調(diào)節(jié)作用。由于機(jī)體自身的代償作用，使這種表型隨月齡增長(zhǎng)而逐漸消失，因此我們將用Lrp2bp轉(zhuǎn)基因小鼠與轉(zhuǎn)基因擴(kuò)張型心肌病和肥厚型心肌病小鼠雜交，進(jìn)一步研究Lrp2bp在心肌病發(fā)病中的作用，為心肌病的機(jī)制研究和治療提供線索。

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Com pensation Effect of L rp2bp on the Heart Function in the Heart Tissue Specific Transgenic M ice

ZHANG Li，QUAN Xiong－zhi，DONG Wei，WANG Shu－mei，ZHANG Xiao－juan，GE Wen－ping，GAO Shan，ZHANG Lian－feng*
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo generate heart tissue specific Lrp2bp transgenic mouse and to study its effects on cardiomyopathy.M ethods The transgenic plasmid was constructed by inserting the murine Lrp2bp gene into the downstream of α－MHC promoter.The transgenic mice were created by microinjection.The genotype of transgenic line was identified by PCR and the expression level of the gene was determined by Western blotting.The cardiac function and geometry were detected by echocardiography.The ultrastructural changes of cardiomyocytes from Lrp2bp transgenic mice were observed by transmission electron microscopy.Results Three lines of C57BL/6J transgenic mice with high level of Lrp2bp expression were identified from four transgenic founders.At 1 month old，the Lrp2bp transgenic mice showed increased thickness of the ventricular wall，dilated ventricular chamber，decreased ejection fraction and decreased fractional shortening compared with that of wild type mice.ConlusionTransgenic mice with cardiac tissue specific Lrp2bp gene have been established successfully and Lrp2bp caused compensation effect on the cardiomyopathy in the transgenic mice.

Lrp2bp;Transgenic mouse;Heart;Compensation

R349.6

A

1005－4847(2010)02－0131－05

2009－12－17

衛(wèi)生部項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036)和十一五新藥專項(xiàng)支持(2009ZX09501－026)。

張麗，女，博士研究生，E－mail:zhangliqq2004@126.com

張連峰，Tel:86－010－87778442;E－mail:Zhanglf@cnilas.org