大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離的改良及其MMP表達(dá)

黃琛，李穎，陳曉勇，許永根，張純，王薇

(北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科，北京大學(xué)眼科中心，北京 100191)

研究報(bào)告

大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離的改良及其MMP表達(dá)

黃琛，李穎，陳曉勇，許永根，張純，王薇

(北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科，北京大學(xué)眼科中心，北京 100191)

目的探索和優(yōu)化大鼠視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，評(píng)價(jià)RPE細(xì)胞的存活狀態(tài)及細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)，為相關(guān)眼底疾病的研究提供細(xì)胞來(lái)源。方法采用改良的三步酶消化法分離大鼠RPE細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)代數(shù)的RPE細(xì)胞的增殖活力。免疫熒光檢測(cè)CRALBP和角蛋白表達(dá)鑒定RPE細(xì)胞，并觀察不同培養(yǎng)代數(shù)RPE細(xì)胞中多種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。結(jié)果分離培養(yǎng)的RPE細(xì)胞可呈梭形、六角形，并維持RPE細(xì)胞特征性蛋白CRALBP和角蛋白表達(dá)，但細(xì)胞內(nèi)色素成分隨著細(xì)胞分裂和傳代次數(shù)的增多逐漸減少?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP3、MMP9和MMP10在第1代和第3代RPE細(xì)胞中均表達(dá)陽(yáng)性，且表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯改變。結(jié)論應(yīng)用改良的三步酶消化法可以成功的分離培養(yǎng)大鼠RPE細(xì)胞，并在第1代和第3代RPE細(xì)胞維持基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP3、MMP9和MMP10的陽(yáng)性表達(dá)。體外培養(yǎng)的大鼠RPE細(xì)胞為研究視網(wǎng)膜相關(guān)疾病提供了細(xì)胞模型。

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞;基質(zhì)金屬蛋白酶;細(xì)胞培養(yǎng);大鼠

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)位于脈絡(luò)膜和光感受器細(xì)胞外節(jié)之間，是視網(wǎng)膜下腔和脈絡(luò)膜血管之間的離子、水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝終產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)通道，參與視黃醇循環(huán)，吞噬脫落的光感受器細(xì)胞外節(jié)以維持光感受器細(xì)胞興奮性，并分泌多種生長(zhǎng)因子，幫助維持脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性［1，2］。充分體現(xiàn)了RPE在維持視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)及功能穩(wěn)定所發(fā)揮的重要作用。在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、視網(wǎng)膜新生血管性疾病中均涉及RPE細(xì)胞的游離、增殖和遷移，其過(guò)程可能與RPE細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)有關(guān)［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶是一組Zn2+離子依賴性內(nèi)肽酶，主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，在細(xì)胞遷移、組織重建和修復(fù)等病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用。

含色素的Brown Norway(BN)大鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與人類(lèi)相似，可作為動(dòng)物模型用于多種視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的研究。但由于大鼠眼球小，RPE細(xì)胞層與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層、脈絡(luò)膜連接緊密，使體外分離培養(yǎng)獲得的RPE細(xì)胞量少，容易混雜其他視網(wǎng)膜組織細(xì)胞或脈絡(luò)膜細(xì)胞，不利于進(jìn)一步的體外研究。本研究采用改良的三步酶消化法成功分離和培養(yǎng)大鼠RPE細(xì)胞，并對(duì)其基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

DMSO(Sigma公司，美國(guó));DMEM－F12培養(yǎng)液(Gibco公司，美國(guó));MTT(Sigma公司，美國(guó));酶聯(lián)免疫測(cè)定儀(BioRad公司，美國(guó));CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本);倒置熒光顯微鏡(Nikon公司，日本);6孔－，12孔－，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning公司，美國(guó))。

1.2 大鼠RPE細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)

健康雄性BN大鼠，體重200～250 g，麻醉后處死，75%酒精浸泡10 m in，無(wú)菌條件下摘取眼球，修剪眼球壁軟組織后置入含有400 U/m L慶大霉素的生理鹽水中，4℃下放置30 min。至角膜緣后環(huán)形剪去眼球前節(jié)，初步去除玻璃體。采用215 U/ m L透明質(zhì)酸酶進(jìn)行第一步酶消化，室溫消化眼杯3 min，用眼科鑷進(jìn)一步去除視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮表面的殘存玻璃體。在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮表面滴加含有215 U/m L透明質(zhì)酸酶、0.125%胰蛋白酶－0.01% EDTA的消化液，室溫消化3 min，進(jìn)行第二步酶消化。將松解脫離的神經(jīng)上皮層輕輕揭去，再加入0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化15 min，進(jìn)行第三步酶消化。加入含有10%胎牛血清DMEM－F12培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打使RPE細(xì)胞脫離，將RPE細(xì)胞懸液以(4～5)×104/m L接種于培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，48 h后，完全培養(yǎng)基換液，待細(xì)胞匯合80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化，傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 生長(zhǎng)曲線(M TT法)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第一代、第三代、第六代大鼠RPE細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化液消化后制備成單細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，將其置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天每種細(xì)胞取6孔采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。每孔待測(cè)的細(xì)胞加入MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄原液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫震蕩15 m in。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。連續(xù)培養(yǎng)7d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 免疫熒光

細(xì)胞爬片經(jīng)固定、漂洗、破膜處理后，加入正常的山羊血清封閉，然后分別加入抗CRALBP、角蛋白8、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10抗體，再次漂洗后加入TRITC標(biāo)記的IgG二抗，然后用Hoechst 33342染核。

2 結(jié)果

2.1 大鼠RPE細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)

剛剛分離的大鼠RPE細(xì)胞呈圓形，大小均一，胞質(zhì)內(nèi)含大量黑色或褐色色素顆粒，細(xì)胞核不可見(jiàn)。RPE細(xì)胞在接種24 h后完全貼壁，細(xì)胞伸展，成多角形或不規(guī)則形，色素顆粒聚集在細(xì)胞核周?chē)?，?xì)胞核清晰可見(jiàn)。接種48 h后，細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖，可見(jiàn)明顯的雙核細(xì)胞。原代培養(yǎng)的細(xì)胞在5 d左右融合，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞3 d左右融合。隨著細(xì)胞分裂的進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)色素逐漸稀釋減少，細(xì)胞逐漸透明，3～4代RPE細(xì)胞質(zhì)中已無(wú)明顯的色素顆粒。同時(shí)，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變，由原代的含大量色素的多邊形細(xì)胞逐漸變成透明的長(zhǎng)梭形細(xì)胞和不規(guī)則形(見(jiàn)圖1)。

2.2 大鼠RPE細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

RPE細(xì)胞接種后24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，處于潛伏期。第1代和第3代大鼠RPE細(xì)胞在第2天進(jìn)入細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3～4 d生長(zhǎng)顯著，隨后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定時(shí)期，且第1代細(xì)胞和第3代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線形狀及吸光值無(wú)明顯差異，提示這兩代細(xì)胞具有相似的細(xì)胞增殖活性。而第6代細(xì)胞生長(zhǎng)明顯慢于第1、3代細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。

注:a.原代RPE細(xì)胞;b.第1代RPE細(xì)胞;c.第3代RPE細(xì)胞;d.第6代RPE細(xì)胞.圖1大鼠RPE細(xì)胞培養(yǎng)Note:a.Primary passage RPE cells;b.Passage 1 RPE cells;c.Passage 3 RPE cells;d.Passage 6 RPE cells.Fig.1 Cultured rat RPE cells in vitro.

圖2 大鼠RPE細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of the rat RPE cells in different passages.

2.3 大鼠RPE細(xì)胞的鑒定

采用免疫熒光法檢測(cè)第1代、第3代和第6代大鼠RPE細(xì)胞中，角蛋白8和CRALBP的表達(dá)。結(jié)果顯示，角蛋白8和CRALBP在第1代、第3代和第6代RPE細(xì)胞均表達(dá)陽(yáng)性，且表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯改變(圖3，彩插2)。

2.4 大鼠RPE細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)

如圖4(彩插3)所示，第1代和第3代RPE細(xì)胞中MMP2、MMP3、MMP9和MMP10蛋白均表達(dá)陽(yáng)性，且表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯改變。而第6代RPE細(xì)胞中，MMP2和MMP3依然持續(xù)表達(dá)，MMP9和MMP10蛋白表達(dá)減弱。

3 討論

大鼠作為動(dòng)物模型已被廣泛應(yīng)用于光損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的研究［4］。然而，由于大鼠眼球較小，RPE細(xì)胞層與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層、脈絡(luò)膜連接緊密，傳統(tǒng)的體外分離法獲得的RPE細(xì)胞量較少，且易混雜其他視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織細(xì)胞，阻礙了大鼠RPE細(xì)胞的體外研究應(yīng)用。本研究采用三步酶消化法，首先在解剖顯微鏡下初步去除玻璃體后，采用215 U/m L透明質(zhì)酸酶進(jìn)行第一步酶消化。玻璃體主要由水、膠原纖維與透明質(zhì)酸組成，單純的透明質(zhì)酸酶消化3min可以有效的解離視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮表面的殘存玻璃體，使之易于去除，不會(huì)影響對(duì)視網(wǎng)膜組織的進(jìn)一步消化。隨后，在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮表面滴加含有215 U/mL透明質(zhì)酸酶、0.125%胰蛋白酶－0.01%EDTA的消化液，進(jìn)行第二步酶消化。透明質(zhì)酸酶和胰蛋白酶的混合液能有效松解視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮和RPE細(xì)胞層之間的緊密連接，確保在完全揭去神經(jīng)上皮的同時(shí)不會(huì)帶離其下的RPE細(xì)胞。最后采用胰蛋白酶消化RPE細(xì)胞，獲得單細(xì)胞懸液。通過(guò)以上三步酶消化法，獲得的RPE細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞活力好，貼壁率高，體外生長(zhǎng)旺盛。

大鼠原代RPE細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí)仍含有大量黑色素顆粒，并保持其原有的形態(tài)。RPE細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中不能產(chǎn)生黑色素，所以隨著傳代的遞增，黑色素顆粒日趨減少。RPE細(xì)胞在第1代時(shí)色素顆粒明顯減少，第3代細(xì)胞色素完全消失，細(xì)胞呈透明狀。生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，細(xì)胞傳的代數(shù)越多，細(xì)胞活性則越不穩(wěn)定，因此在進(jìn)行RPE的相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以采用第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)采用CRALBP和角蛋白8作為RPE鑒定的特異性抗體標(biāo)志。CRALBP是視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞中的功能蛋白，主要參與視覺(jué)環(huán)路中11－順視黃醛的異構(gòu)化過(guò)程，激發(fā)全－反視黃醛酶解轉(zhuǎn)化為11－順視黃醛［5］。角蛋白8是上皮細(xì)胞特異性的標(biāo)志蛋白［6］。免疫熒光顯示培養(yǎng)的RPE細(xì)胞CRALBP和角蛋白8持續(xù)陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)獲得和培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠RPE細(xì)胞。

MMP是一組在結(jié)構(gòu)上具有明顯同源性的Zn2+依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶，是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)最重要的酶系統(tǒng)。目前研究認(rèn)為，PVR基本病理過(guò)程是RPE細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、增生和收縮，并且與RPE細(xì)胞分泌MMP蛋白降解細(xì)胞外基質(zhì)成分有關(guān)［7］。而在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)中，MMP蛋白的表達(dá)增加與新生血管形成密切相關(guān)［8］。在年齡相關(guān)性黃斑變性的特征性病變，黃斑區(qū)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成的早期，MMP活化是重要步驟。動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，MMP2和MMP9聯(lián)合表達(dá)缺失的小鼠中，CNV產(chǎn)生明顯少于MMP2、MMP9各自基因表達(dá)缺失的小鼠，提示MMP2和MMP9的聯(lián)合作用對(duì)CNV產(chǎn)生的重要性［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，在第1代和第3代體外培養(yǎng)的大鼠RPE細(xì)胞中MMP2、MMP3、MMP9和MMP10蛋白均表達(dá)陽(yáng)性，且表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯改變。而第6代RPE細(xì)胞中，MMP2和MMP3依然持續(xù)表達(dá)，MMP9和MMP10蛋白表達(dá)減弱。提示，培養(yǎng)第3代的大鼠RPE細(xì)胞最具代表性，適合用于體外研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三步酶消化法是一種簡(jiǎn)單有效的體外分離大鼠RPE細(xì)胞的方法，細(xì)胞收獲量多，并能保持RPE的形態(tài)和功能正常。大鼠RPE細(xì)胞的成功體外培養(yǎng)為研究RPE細(xì)胞的功能、相關(guān)眼底病變機(jī)理及治療提供可靠的體外手段。

(本文圖3～4見(jiàn)彩插2，3。)

［1］Schraermeyer U，Heimann K.Current understanding on the role of retinal pigment epithelium and its pigmentation［J］.Pigment Cell Res，1999，12(4):219－236.

［2］Strauss O.The retinal pigment epithelium in visual function［J］.Physiol Rev，2005，85(3):845－881.

［3］Hoffmann S，He S，Ehren M，et al.MMP－2 and MMP－9 secretion by rpe is stimulated by angiogenic molecules found in choroidal neovascular membranes［J］.Retina，2006，26(4): 454－461.

［4］Yu DY，Cringle SJ.Retinal degeneration and local oxygen metabolism［J］.Exp Eye Res，2005，80(6):745－751.

［5］Saari JC，Bredberg L，Garwin GG.Identification of the endogenous retinoids associated with three cellular retinoidbinding proteins from bovine retina and retinal pigment epithelium［J］.J Biol Chem，1982，257(22):13329－13333.

［6］Agata K，Kobayashi H，Itoh Y，et al.Genetic characterization of the multipotent dedifferentiated state of pigmented epithelial cells in vitro［J］.Development，1993，118(4):1025－1030.

［7］Glaser BM，Cardin A，Biscoe B.Proliferative vitreoretinopathy. The mechanism of development of vitreoretinal traction［J］. Ophthalmology，1987，94(4):327－332.

［8］Beránek M，Kolar P，Tschoplova S，et al.Genetic variations and plasma levels of gelatinase A(matrix metalloproteinase－2) and gelatinase B(matrix metalloproteinase－9)in proliferative diabetic retinopathy［J］.Mol Vis，2008，14:1114－1121.

［9］Lambert V，Wielockx B，Munaut C，et al.MMP－2 and MMP－9 synergize in promoting choroidal neovascularization［J］.FASEB J，2003，17(15):2290－2292.

A M odified M ethod of Isolation of Rat Retinal Pigm ent Epithelial Cells and the Exp ression of M atrix M etallop roteinases in the Cu ltured Cells

HUANG Chen，LI Ying，CHEN Xiao－yong，XU Yong－gen，ZHANG Chun，WANG Wei
(Department of Ophthalmology，Peking University Third Hospital，Peking University Eye Center，Beijing 100191，China)

ObjectiveTo improve the isolation and culture techniques of rat retinal pigment epithelial(RPE) cells and investigate the expression of matrix metalloproteinases(MMPs)in the cultured RPE cells.M ethods The brown Norway(BN)rat RPE cells were isolated by a modified three－step enzyme digestion.The growth curves of the RPE cells of different passages were measured.The expression of marker protein CRALBP and cytokeratin，and MMPs in the RPE cells of different passages were observed by immunofluorescence microscopy.ResultsThe primary cultured RPE cells showed a polygonal shape and contained a large amount of pigments.The pigment in the cells was gradually lost at later passages as a result of dilution by cell division.Immunofluorescence microscopy detected the positive expression of specific markers CRALBP and cytokeratin in the RPE cells.Positive expressions of MMP2，MMP3，MMP9 and MMP10 were found in passage 1 and 3 RPE cells.ConlusionA larger amount of RPE cells can be obtained by this modified three－step enzymatic digestion.The positively passaged MMP2－，MMP3－，MMP9－and MMP10－expressing RPE cells may become useful cell models for further studies of retinal diseases.

Retinal pigment epithelial cell;Matrix metalloproteinase;Enzyme digestion;Cell culture;Rat

R779112

A

1005－4847(2010)02－0109－04

2009－09－15

國(guó)家自然科學(xué)基金(NO.30672284);中國(guó)博士后科學(xué)基金(20080430288)資助。

黃琛(1978－)，女，講師，在站博士后。E－mail:candyhuang719@hotmail.com

王薇，教授。E－mail:puh3_ww@bjmu.edu.cn