白腐菌預處理對粉單竹化學成分和微觀纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

熊建華程 昊王雙飛李可成

(1.廣西大學化學化工學院,廣西南寧,530004;2.廣西工學院生化系,廣西柳州,545006;

3.廣西大學造紙科學研究所,廣西南寧,530004;4.加拿大New Brunswick大學,加拿大弗雷德里克頓,E3B6C2)

白腐菌預處理對粉單竹化學成分和微觀纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

熊建華1,2,3,4程 昊2王雙飛3,＊李可成4

(1.廣西大學化學化工學院,廣西南寧,530004;2.廣西工學院生化系,廣西柳州,545006;

3.廣西大學造紙科學研究所,廣西南寧,530004;4.加拿大New Brunswick大學,加拿大弗雷德里克頓,E3B6C2)

3種白腐菌菌株對粉單竹進行1～4周的生物培養(yǎng),通過考察竹片在生物預處理后質(zhì)量損失率、木素去除率、綜纖維素損失率、木素降解選擇因子的變化,篩選出能夠選擇性有效去除竹片木素的白腐菌Trametes hirsuta19-6作為研究對象。用顯微鏡觀測粉單竹纖維細胞壁的結(jié)構(gòu)特點,以及白腐菌預處理引起的竹片纖維微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,探討白腐菌生物降解竹片的機理。

粉單竹;生物機械制漿;掃描電子顯微鏡;透射電鏡;白腐菌

自然界中有數(shù)千種白腐菌可以不同程度地降解木素、纖維素和半纖維素。白腐菌有能力降解纖維細胞的所有成分,包括木素。不同白腐菌對木素、纖維素和半纖維素的降解程度差異很大,很多菌種是沒有選擇性或有選擇性地襲擊同一原料的不同區(qū)域,從而產(chǎn)生了生物降解過程的不同。不同的菌屬對不同類型的材種有不同的作用效果,即使同一菌屬的不同白腐菌對纖維細胞成分的生物降解能力差別也很大[1]。

生物制漿需要篩選出能夠選擇性降解木素的白腐菌,篩選的原則是生長快速而且能夠選擇性地有效去除木素。最初菌種的篩選是根據(jù)原料化學成分的變化來確定木素的去除效率,其優(yōu)點是能夠直觀反應木素的降解情況。之前對于白腐菌菌種的篩選和降解機理的研究較多集中在木材纖維原料上,對于非木材纖維原料,國內(nèi)已有對麥草和蔗渣研究的相關(guān)報道[2-4]。竹子作為一種非常重要的非木材纖維原料,在白腐菌預處理的機理和生物制漿領域的研究報道甚少。因此,本研究用生物處理前后化學成分的變化來初步篩選有效預處理竹片的白腐菌,同時,借助顯微鏡觀察生物預處理對竹纖維細胞壁的腐蝕情況,為竹子生物化機漿的研究提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 實驗原料

本研究所用的粉單竹產(chǎn)自廣西,竹子切片(2 cm× 2 cm×0.2 cm)后在空氣中干燥并儲存,在生物預處理前,竹片在水中浸泡12 h。本研究采用的3種白腐菌菌株Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)和P.chrysosporium(Pc-1767)由華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室提供。所有菌株均保存在PDA斜面固體培養(yǎng)基中,菌株特性如下。

Pc-1767主要分泌木素酶(Lip)、錳過氧化物酶(Mnp)、纖維素酶和半纖維素酶,之前的研究表明Pc-1767最適宜的生長溫度為39℃、pH值為4.5[4]。

Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)是從竹子上分離出的新菌種,它們主要分泌錳過氧化物酶、漆酶、纖維素酶和半纖維素酶。Tram etes hirsut 19-6為野生白腐菌Tram etes hirsute19-6(w)馴化得到的菌株,其纖維素酶的分泌量低于19-6(w)菌株。白腐菌Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)最適宜的生長溫度為28℃、pH值為4.5[5]。

1.2 竹片的預處理

竹片測定水分后分別在1000 mL的錐形瓶中裝入80 g絕干竹片,再加入營養(yǎng)液和無菌水,相對濕度保持在70%～80%。調(diào)節(jié)初始pH值為4.5,經(jīng)過高溫(121℃,30 min)滅菌后,在無菌條件下轉(zhuǎn)接10 mL懸浮菌絲液。懸浮菌絲液的制備見參考文獻[5]。裝有白腐菌Tram etes hirsute19-6、Tram etes hirsute19-6(w)的樣品在28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),而Pc-1767則在39℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有樣品每天充氧15 min,靜置培養(yǎng)1～4周。

1.3 竹片化學成分的測定

竹子原料化學成分的分析方法見參考文獻[6]。經(jīng)白腐菌處理的竹片用蒸餾水浸泡后將表面的菌絲體沖洗掉,自然風干后稱量,根據(jù)生物預處理前后的質(zhì)量差計算質(zhì)量損失率。Klason木素含量根據(jù)相關(guān)國家標準測定。白腐菌的脫木素能力可用竹片質(zhì)量損失率、殘留木素含量、木素降解選擇因子來評估。

竹片質(zhì)量損失率=(竹片處理前質(zhì)量-竹片處理后質(zhì)量)/竹片處理前質(zhì)量

綜纖維素損失率=竹片質(zhì)量損失率-木素損失率

木素降解選擇因子(SF)=木素損失率/綜纖維素損失率

1.4 竹片微觀纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀測

竹片微觀纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀測見參考文獻[6]中植物纖維原料生物結(jié)構(gòu)的觀察部分。

2 結(jié)果與討論

2.1 粉單竹的化學組成和纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)

粉單竹的化學組成見表1。由表1可見,粉單竹的纖維素和戊聚糖含量較高,木素含量較低,適合用于生產(chǎn)化機漿和生物化機漿。

表1 粉單竹的化學組成%

通過掃描電鏡和透射電鏡觀察到的粉單竹纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1～圖3所示。由圖1可知,粉單竹含有較多的薄壁細胞,細胞壁較薄而細胞腔較大。竹子的表皮細胞組織緊密,細胞壁表面光滑完整,沒有任何空洞和凹穴,藥液和菌絲都難以從表皮細胞組織滲入。同時薄壁細胞的細胞壁又具有薄的初生壁和厚的次生壁(見圖2和圖3)。粉單竹的薄壁竹纖維為多層復合結(jié)構(gòu),多層的次生壁結(jié)構(gòu)中寬層和窄層交替分布,層與層之間還有黑的線條出現(xiàn),胞間層和細胞角隅結(jié)構(gòu)組織相對疏松。多層的次生壁結(jié)構(gòu)是竹子纖維形態(tài)的一個重要特征,早期的研究結(jié)果顯示,竹子的木素含量主要集中在胞間層、細胞角隅和次生壁的窄層[7-8]。

2.2 白腐菌生物預處理對竹片化學成分的影響

竹片在添加營養(yǎng)液和供氧的條件下用3種菌種分別預處理1～4周,計算出質(zhì)量損失和殘余木素含量,而綜纖維素損失和木素降解選擇因子可通過木素損失和質(zhì)量損失計算得出,結(jié)果見表2。已有研究證實,聚糖類和木素的降解分別在白腐菌生長的初生和次生階段發(fā)生。當白腐菌在木質(zhì)纖維原料上繁衍時,首先從菌絲中分泌出纖維素酶和半纖維素酶,降解部分聚糖類以供給真菌生長所需要的營養(yǎng)物,在消耗聚糖類降解產(chǎn)物及生長蔓延的過程中,分泌出一系列木素降解酶,此時生物進入木素降解階段[4]。

表2 不同白腐菌預處理后竹片化學成分的變化

2.2.1 白腐菌生物預處理對竹片質(zhì)量損失率的影響

在1～4周的培養(yǎng)過程中,白腐菌Thrametes hirsute19-6預處理的竹片質(zhì)量損失率為8.53%～12.66%, Trametes hirsute19-6(w)為7.01%～10.07%,Pc-1767為8.08%～8.69%。這說明白腐菌Trametes hirsute19-6預處理帶來的質(zhì)量損失率要高于Trametes hirsute19-6 (w)和Pc-1767。因此,白腐菌種類對竹片質(zhì)量損失率是有影響的。

隨培養(yǎng)時間的延長,質(zhì)量損失率也相應增加。質(zhì)量損失率增加的速率在3周后變緩慢,表明白腐菌的生物降解主要發(fā)生在早期。前期的研究表明,白腐菌降解木素的同時也伴隨著碳水化合物的降解,有些能選擇性降解木素的白腐菌在去除大量木素的同時也有少量的纖維素和半纖維素損失,而有些白腐菌則同時去除大量的多糖類物質(zhì)和木素。因此,質(zhì)量損失包含木素損失和綜纖維素損失。

2.2.2 白腐菌生物預處理對竹片木素去除率的影響

在1～4周的培養(yǎng)過程中,白腐菌Trametes hirsute19-6預處理的竹片木素去除率為16.88%～20.68%, Trametes hirsute19-6(w)為15.04%～19.36%,Pc-1767為12.75%～16.72%。即Tram etes hirsute19-6的木素去除效果最好,同時Tram etes hirsute19-6(w)的木素去除率要高于Pc-1767。白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)與Pc-1767相比,由于增加了漆酶的分泌作用,可能增強了降解竹片木素的活性。由此可見,不同種類的菌種由于分泌的酶不同,對木素去除率的影響很大。

培養(yǎng)周期也同樣影響木素的去除率,竹片的木素去除率隨培養(yǎng)時間的增加而增加,最大的木素去除率發(fā)生在第4周。菌種的脫木素效率在前2周比較高,后2周比較低。其原因可能是前期營養(yǎng)液的消耗減緩了木素降解,也可能是生物降解的產(chǎn)物積聚在一起影響菌種的生長。生物降解的產(chǎn)物包括苯胺、醛類物質(zhì)以及酸性物質(zhì),這些物質(zhì)會使pH值降低、白腐菌活性鈍化。根據(jù)Kirk的研究[9],P.chrysosporium菌種在木素降解的最終代謝產(chǎn)物CO2的聚集和氧氣含量減少的情況下,相對自然平衡狀態(tài)下白腐菌的生物降解能力減弱。

日本用篩選的白腐菌phlebia sp.MG-60對蔗渣進行30天的生物預處理,木素去除率達50%以上,而綜纖維素的損失率不足10%,認為白腐菌phlebia sp. MG-60能夠選擇性降解蔗渣木素[10]。Tram etes hir sute19-6在去除20.68%木素的同時只有5.84%的綜纖維素損失,因此,可以認為Tram etes hirsute19-6能夠選擇性降解竹片木素。

2.2.3 白腐菌生物預處理對竹片綜纖維素損失率的影響

在1～4周的培養(yǎng)過程中,白腐菌Tram etes hir sute19-6預處理的竹片綜纖維素損失率為3.21%～5.84%,Tram etes hirsute19-6(w)為2.35%～3.97%, Pc-1767為3.37%～3.68%。Tram etes hirsute19-6對綜纖維素整體的降解能力要高于Tram etes hirsute19-6 (w)和Pc-1767。Pc-1767能選擇性降解白楊的木素而只有少量的纖維素損失[11],但Pc-1767對竹片的脫木素效果并不是很有效。

2.2.4 白腐菌生物預處理對木素降解選擇因子的影響

白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6 (w)選擇性降解木素的選擇因子隨培養(yǎng)時間增加而降低,而Pc-1767則隨培養(yǎng)時間增加而增加。白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)選擇性脫木素的選擇因子最大值出現(xiàn)在第1周,說明白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)選擇性去除木素主要發(fā)生在早期,延長培養(yǎng)時間并不能增加選擇性脫木素的效率,反而會提高綜纖維素損失率,因此,2～3周培養(yǎng)時間對于Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)來說比較經(jīng)濟合理。先前對于其他菌種的研究也表明延長培養(yǎng)時間并不能提高選擇性脫木素的效率。Pc-1767選擇性降解木素的選擇因子隨培養(yǎng)時間的延長從1.20增加到1.58,說明Pc 1767對竹片的脫木素作用需要較長時間的培養(yǎng),同時也會提高綜纖維素損失率。

2.3 白腐菌生物預處理對竹片纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

利用電子顯微鏡能夠準確觀察白腐菌在植物纖維原料上生長時纖維微觀結(jié)構(gòu)的變化,并且已經(jīng)被證明是研究白腐菌生長方式的一種有效手段。本研究選用白腐菌Tram etes hirsute19-6對竹片預處理2周,觀察白腐菌對粉單竹纖維細胞壁的降解情況。

白腐菌降解木素時并不是只發(fā)生在纖維細胞壁的某一層或某一特殊的區(qū)域,而是貫穿整個細胞壁的所有區(qū)域[12-13]。白腐菌降解纖維的路徑有兩種不同的說法。余惠生發(fā)現(xiàn)白腐菌Panus conchatus在降解稻草木素時,它首先攻擊木素濃度最高的纖維胞間層,使胞間層的木素迅速降解,然后再逐漸降解其他各層的木素[2]。但大多數(shù)的研究表明[14],白腐菌降解木片的路徑與化學蒸煮工藝中蒸煮液的滲透路徑相似,白腐菌首先進入纖維細胞腔,并迅速占據(jù)富含游離糖分和養(yǎng)分的射線細胞(這種輻射排列的射線細胞有利于白腐菌迅速進入木片內(nèi)部),一旦這些易于攝取的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡,白腐菌對細胞壁的降解就正式開始,菌絲開始沿著細胞腔壁向胞間層方向逐層地降解木素,最終導致纖維從胞間層分離。

木材的生物腐蝕顯示白腐菌的生物降解主要是木素﹑半纖維素和纖維素。生物降解的次序通常與木素和多糖類物質(zhì)在細胞腔的分布有關(guān)。木材纖維的木素主要分布在細胞腔的胞間層和細胞角隅,多糖類物質(zhì)主要集中在次生壁。能夠選擇性降解木素的白腐菌主要是降解胞間層和次生壁的木素,留下次生壁的纖維素。通過透射電鏡可以看出,白腐菌對竹片的生物降解也是從細胞腔開始。白腐菌首先進入竹片細胞腔內(nèi),快速降解含有糖類和營養(yǎng)物質(zhì)的細胞射線軟組織。細胞內(nèi)射線軟組織的排列又使白腐菌在細胞腔內(nèi)更廣泛的分布,并使臨近的細胞出現(xiàn)凹穴或是菌絲直接穿過細胞壁向外滲透(見圖4),一旦細胞腔內(nèi)容易被白腐菌吸收的物質(zhì)耗盡,就開始降解纖維細胞壁。白腐菌通過細胞腔邊緣向次生壁和胞間層延伸,進一步攻擊纖維細胞的次生壁,使竹片含有復合層狀結(jié)構(gòu)的次生壁從內(nèi)層出現(xiàn)剝離(見圖5),整個次生壁開始變薄,細胞組織結(jié)構(gòu)變疏松(見圖6)。隨著白腐菌對次生壁的降解,白腐菌同時侵襲細胞壁的所有組分,從而使纖維細胞壁不同的層狀結(jié)構(gòu)被局部腐蝕,菌絲又穿過細胞壁對胞間層和疏松的細胞角隅進行攻擊(見圖7)。由于竹片的木素含量主要集中在胞間層、細胞角隅和次生壁的窄層,生物作用的結(jié)果使得次生壁、復合胞間層和細胞角隅的部分木素被逐步降解。次生壁首先被分解、變薄,隨著脫木素的進行,胞間層被降解的相鄰細胞彼此分離。竹片結(jié)構(gòu)的松弛、纖維細胞壁層間發(fā)生的分離以及被軟化和瓦解的細胞組織有利于化學預處理過程中藥品的滲透,從而更有效地降解木素,在磨漿過程中使纖維容易分離且節(jié)約能耗。

3 結(jié) 論

3.1 從化學組成看,粉單竹具有較高的纖維素和半纖維素含量以及較低的木素和抽出物含量。從纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)看,粉單竹含有較多的薄壁細胞,細胞壁較薄而細胞腔較大,細胞壁又具有薄的初生壁和厚的次生壁。

3.2 3種白腐菌菌株在各自最佳的培養(yǎng)條件下對粉單竹進行1～4周的預處理,發(fā)現(xiàn)在木素降解的同時都伴隨著纖維素和半纖維素的降解,但纖維素和半纖維素的降解相比木素少很多。木素去除率和竹片質(zhì)量損失率隨培養(yǎng)時間增加而增大,白腐菌Tram etes hirsute19-6和Tram etes hirsute19-6(w)的木素降解選擇因子隨培養(yǎng)時間延長而降低,選擇性脫木素主要集中在處理早期。3種白腐菌菌株中,Tram etes hirsute19-6生物預處理竹片最有效。

3.3 用透射電鏡觀測白腐菌Tram etes hirsute19-6預處理2周的粉單竹纖維細胞壁的結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)白腐菌對竹片的生物降解是從細胞腔開始,從次生壁開始脫除木素,然后延伸到胞間層。

[1] Eriksson K E.Swedish development in biotechnology related to the pulp and paper industry[J].Tappi Journal,1985,68(7):46.

[2] 余惠生.稻草木素生物降解的研究[J].纖維素科學與技術(shù), 1993,76(2):16.

[3] 李建軍,詹懷宇.白腐菌預處理制蔗渣生物機械漿[J].紙和造紙,2001,1(2):58.

[4] 高 楊,王雙飛.甘蔗渣采用白腐菌生物降解的研究[J].華南理工大學學報,1996,24(12):37.

[5] 熊建華.白腐菌預處理竹子化機漿的研究[D].廣西:廣西大學,2007.

[6] 石淑蘭,何福望.制漿造紙分析與檢測[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2003.

[7] Parameswaran N,Liese W.On the polylamellate structure of paren chyma wall in Phyllostachys edufis Riv[J]. IAWA Bull,1975:57.

[8] LieseW.Recent Research on Bamboo[C]//Proceedings of the Inter nationalBambooWorkshop.Hangzhon,1986.

[9] Kirk T K.Production ofmultiple ligninases byPhanerochaete chrysos Porium.effect of selected growth condition and use of a mutant strain [J].EnzymeMicrob.Technol.,1986,8(1):27.

[10] Li Xin,Ryuichiro Kondo,Kokki Sakai.Degradation of Biodugar cane bagassewith marine fungusPhlebiasp.MG-60[J].The Japan Wood Research Society,2002,48(2):159.

[11] Masood Akhta.Biomechanical pulpingof aspenwood chipswith thre strains of Ceriporiopsis subvermispora[J].Holzforschung,1994,48 (3):199.

[12] Dunn C,VanWky PW J,Wolfaardt F.Ultrastructure and pulpin of bagasse,treatedwith white-rot fungi[C]//8th International con ference onbiotechnologyinthepulpandpaperindustry. Finland,2001.

[13] Ruel K,Barnoud F.Ultrastructural changes in the wall of spruc tracheids degraded by Sporotrichum Pulverulentum[M].Florida: CRC Press,1980.

[14] AkhtarM,Blanchette R A,Kirk T K.Fungal Delignification and Biomechanical Pulping ofWood[J].Advances in Biochemical En gineering/Biotechnology,1997,57:159.

Abstract:Three white rot fungi were incubated on white powdery bamboo in the opt imum conditions for 1 to 4 weeks,white rot fung Trametes hirsuta19-6 was screened for efficient selective delignification based on the evaluation of bamboo chipsweight loss,lignin removal, holocellulose lose,the factors affecting selective degradation of lignin.Electron microscopeswere used to study the character ofwhite powder bamboo fiber cellwall structure changes brought by fungal pretrea tment.The mechanis m ofwhite-rot fungi attack on bamboo was studied. Keywords:white powdery bamboo;biomechanical pulping;SEM;TEM;white-rot fungi

(責任編輯:田風洲)

Effects of Pretreat ment of Bamboo byW hite-rot Fungi on its Chem ical Composition and FiberM orphology

X IONG Jian-hua1,2,3,4CHENG Hao2WANG Shuang-fei3,＊L I Ke-cheng4
(1.Department of Chem istry and Chem ical Engineering of Guangxi University,Nanning,Guangxi Zhuang Autonom ous Region,530004; 2.Depar tm ent of B iological and Chem ical Engineering,Guangxi University of Technology,Liuzhou,Guangxi Zhuang Autonom ous Region,545006;3.Pulp&Paper Institute of Guangxi University,Nanning,Guangxi Zhuang Autonom ous Region,530004;4.Depar tm ent of Chem ical Engineering and Lim erick Pulp and Paper Centre,University of New B runswick,Fredericton,NB,Canada,E3B6C2)
(＊E-mail:wangsf@gxu.edu.cn)

TS71+2;TS749

A

1000-6842(2010)02-0027-05

2010-02-01(修改稿)

本課題為國家973計劃前期研究項目(2006CB708600)資助課題。

熊建華,女;博士;主要研究方向:生物制漿及清潔生產(chǎn)。

＊通信聯(lián)系人:王雙飛,E-mail:wangsf@gxu.edu.cn。