大鼠骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷過(guò)程中肌細(xì)胞能量代謝的變化

陳曉光,劉 曄

(1.河南師范大學(xué)體育學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007;2.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)解剖學(xué)教研室,北京 100084)

大鼠骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷過(guò)程中肌細(xì)胞能量代謝的變化

陳曉光1,劉 曄2

(1.河南師范大學(xué)體育學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007;2.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)解剖學(xué)教研室,北京 100084)

通過(guò)采用骨骼肌靜力性負(fù)荷損傷動(dòng)物模型,觀察在所致?lián)p傷過(guò)程中肌糖原含量、骨骼肌線粒體ATP酶活性以及骨骼肌胞漿和血清中乳酸含量的變化,來(lái)探討肌細(xì)胞能量代謝變化與骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的關(guān)系。結(jié)果表明,肌細(xì)胞能源物質(zhì)耗竭、能量供應(yīng)不足以及糖類氧化不足所引起的三羧酸循環(huán)中介物缺乏并非導(dǎo)致骨骼肌靜力性損傷的直接原因,肌細(xì)胞內(nèi)乳酸等代謝產(chǎn)物堆積產(chǎn)生的毒副作用可能是引起骨骼肌靜力性損傷的重要因素。

骨骼肌細(xì)胞;靜力性損傷;能量代謝

目前對(duì)肌細(xì)胞內(nèi)能量物質(zhì)耗竭、合成障礙及代謝產(chǎn)物堆積是否會(huì)導(dǎo)致肌肉損傷存在較大爭(zhēng)議,同時(shí)以往研究大多是針對(duì)離心性或向心性運(yùn)動(dòng)所致的骨骼肌損傷,而靜力性運(yùn)動(dòng)所致的骨骼肌損傷研究較少,缺乏對(duì)其發(fā)生機(jī)制的深入探討。本文通過(guò)骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷動(dòng)物模型,從肌細(xì)胞能量代謝的角度對(duì)靜力性負(fù)荷所致骨骼肌損傷的機(jī)制進(jìn)行探討,以期為大眾健身、勞動(dòng)衛(wèi)生和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

健康純系雄性 SD大鼠 72只(8周齡),體重221.8 ±4.7g,隨機(jī)分成對(duì)照組(CON)、4周實(shí)驗(yàn)組(4WE)、3周實(shí)驗(yàn)組 (3WE)、2周實(shí)驗(yàn)組 (2WE)、1周實(shí)驗(yàn)組(1WE)和 3天實(shí)驗(yàn)組(3DE),每組 12只。適應(yīng) 2天后分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 22±2℃,相對(duì)濕度為 45-55%,自然光照,自由飲食、飲水。

1.2 骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷模型的制作

設(shè)計(jì)自制空心實(shí)驗(yàn)臺(tái),臺(tái)上安裝可調(diào)節(jié)高度的鐵架。鐵架橫梁表面有用以固定大鼠前肢的光滑凹槽。在鐵架下方臺(tái)面鉆 3個(gè)圓孔,2孔在前,相距 3cm,其連線距鐵架橫梁投影線后 5cm并與之平行,用于施加負(fù)荷的砝碼通過(guò)而懸掛在大鼠踝關(guān)節(jié)上,同時(shí)起到固定大鼠后肢保持靜力性運(yùn)動(dòng)的作用;另 1個(gè)孔在前面2孔連線中點(diǎn)后 2cm處,用于實(shí)驗(yàn)中容納鼠尾,避免鼠尾支撐。

實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠前肢固定在鐵架橫梁上,調(diào)節(jié)高度使其兩側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)處于跖屈位支撐站立(以跖趾關(guān)節(jié)最大支撐不離開(kāi)臺(tái)面為標(biāo)準(zhǔn)),并在兩側(cè)踝關(guān)節(jié)處各施加 50%體重的負(fù)荷,每天上、下午各訓(xùn)練 1小時(shí),分別訓(xùn)練 3天、1周、2周、3周和 4周。對(duì)照組不訓(xùn)練,其它條件與實(shí)驗(yàn)組相同。大鼠均在全部訓(xùn)練結(jié)束次日宰殺取材。

通過(guò)光鏡、電鏡切片和血清 CK、LDH檢測(cè)證實(shí),持續(xù) 3天至 4周后肢負(fù)重站立的靜力性負(fù)荷誘發(fā)了大鼠腓腸肌發(fā)生損傷。

1.3 取材與指標(biāo)測(cè)定

乙醚淺麻醉后,眼球取血,然后斷頭處死。血樣以3000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心 10分鐘,分離血清。迅速取出右后肢腓腸肌,放入冷生理鹽水中洗去浮血,剔除脂肪及結(jié)締組織,用濾紙吸干。

稱取腓腸肌 85毫克,采用南京建成生物工程研究所提供的肌糖原試劑盒和 721分光光度計(jì)測(cè)定肌糖原含量。

稱取腓腸肌 2克,以差速離心法制備線粒體和胞漿[1]。采用南京建成生物工程研究所提供的 ATP酶試劑盒和 721分光光度計(jì)分別測(cè)定腓腸肌線粒體中Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和 Na+-K+-ATP的活性。

采用南京建成生物工程研究所提供的乳酸 (LA)試劑盒和 721分光光度計(jì)分別測(cè)定腓腸肌胞漿和血清中乳酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)均以平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,采用單因素方差分析進(jìn)行各組間的差異顯著性檢驗(yàn)。顯著性水平為 P﹤ 0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 施加不同時(shí)間靜力性負(fù)荷對(duì)肌糖原含量的影響

由表 1可見(jiàn),施加 3天至 4周靜力性負(fù)荷后,與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組大鼠肌糖原含量均下降,除 1周組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其余各組均有顯著性差異 (P<0.01或 P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組間肌糖原含量的變化趨勢(shì)表現(xiàn)為施加負(fù)荷 3天時(shí)已明顯下降,較對(duì)照組降低 14.7% (P<0.05),1周時(shí)略有恢復(fù) (P>0.05);2周時(shí)下降明顯,與對(duì)照組、3天組和 1周組相比分別降低 37.8%、27.1%和 33.7%,均有極顯著性差異 (P<0.01);3周時(shí)又明顯回升,較 2周組升高 42.2%(P<0.01),但仍較對(duì)照組降低了 11.6%(P<0.05);至第 4周時(shí)急劇下降,較對(duì)照組降低 64.1%(P<0.01),較第 3周降低59%(P<0.01),與其余各組也有非常顯著性差異 (P <0.01)。

表 1 施加不同時(shí)間靜力性負(fù)荷后肌糖原與乳酸含量的變化

2.2 施加不同時(shí)間靜力性負(fù)荷對(duì)腓腸肌胞漿乳酸含量的影響

由表 1可見(jiàn),施加 3天至 4周靜力性負(fù)荷后,各實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌胞漿乳酸含量均顯著升高,與對(duì)照組相比均有極顯著性差異(P<0.01)。其變化趨勢(shì)表現(xiàn)為 3天至 1周時(shí)持續(xù)上升,分別較對(duì)照組升高了 20%和 27.3%。2周至 4周時(shí)骨骼肌胞漿乳酸增加更為明顯,分別較對(duì)照組升高了 61.8%、85.4%和 58.2%,與3天、1周時(shí)相比亦均有顯著性差異。3周時(shí)含量最高,至第 4周時(shí)略有回落,與 3周時(shí)相比具有顯著性差異(P<0.05),但仍顯著高于對(duì)照組、3天組和 1周組(P<0.01)。

2.3 施加不同時(shí)間靜力性負(fù)荷對(duì)血清乳酸含量的影響

施加 3天至 4周靜力性負(fù)荷后,各實(shí)驗(yàn)組大鼠血乳酸含量與對(duì)照組相比均顯著升高 (P<0.01)。盡管各實(shí)驗(yàn)組間血乳酸含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但與骨骼肌胞漿乳酸一樣,也表現(xiàn)出2至4周時(shí)高于3天至1周時(shí)的趨勢(shì)(見(jiàn)表 1)。

2.4 施加不同時(shí)間靜力性負(fù)荷對(duì)骨骼肌線粒體 ATP酶活性的影響

由表 2可見(jiàn),施加 3天至 4周靜力性負(fù)荷后,各實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌線粒體 Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶與Na+-K+-ATP酶活性與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.01)。其變化趨勢(shì)均表現(xiàn)為 3天和 1周時(shí)較為穩(wěn)定,2至 4周時(shí)增加更為明顯。

表 2 施加不同時(shí)間靜力性負(fù)荷后線粒體ATP酶活性(μmolPi/mgProt/hour)的變化

3 分析與討論

骨骼肌中的糖原經(jīng)過(guò)有氧氧化或無(wú)氧酵解,釋放能量合成ATP,是肌肉處于長(zhǎng)時(shí)間收縮狀態(tài)時(shí)的主要供能物質(zhì)。以往很多研究均發(fā)現(xiàn)肌肉疲勞和損傷發(fā)生的同時(shí)伴隨著肌糖原的耗竭。Entman[2]和 Friden[3]等的研究表明,肌糖原耗竭可導(dǎo)致 ATP含量下降,影響骨骼肌興奮 -收縮耦聯(lián)過(guò)程,并使肌原纖維蛋白的功能受損。Bergstrom等[4]認(rèn)為在從中等到大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中,肌糖原不僅是主要的能量來(lái)源,而且是必不可少的底物,因此它的大量減少將引起 ATP含量降低,導(dǎo)致疲勞甚至損傷。Sahlin等[5]的研究認(rèn)為NADH的最大氧化和電子傳遞或脂肪氧化的維持均需一定水平的糖類氧化,如果糖類氧化不足,三羧酸循環(huán)中的中介物也將不足,最終導(dǎo)致肌肉疲勞和損傷。

但也有報(bào)道認(rèn)為在長(zhǎng)時(shí)間訓(xùn)練中肌糖原耗竭、低血糖及糖類氧化的降低并不是導(dǎo)致肌肉疲勞和損傷的主要因素。Coyle等[6,7]研究發(fā)現(xiàn):即使血糖和糖類氧化率保持在正常水平時(shí)實(shí)驗(yàn)組依舊會(huì)發(fā)生疲勞。

本研究結(jié)果表明,在骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷過(guò)程中,大鼠肌糖原含量均下降,除 1周實(shí)驗(yàn)組外,其余各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有顯著性差異。同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組骨骼肌胞漿乳酸和血乳酸含量均顯著升高,并表現(xiàn)出

2-4周時(shí)高于 3天至 1周時(shí)的趨勢(shì)。這表明大鼠進(jìn)行靜力性運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中肌糖原作為能源物質(zhì)直接參與了糖酵解供能,導(dǎo)致含量下降。這一結(jié)果排除了由于糖類氧化不足造成三羧酸循環(huán)的中介物不足而導(dǎo)致骨骼肌靜力性損傷的可能性。

同時(shí),本研究中在施加負(fù)荷的第 1周時(shí),肌糖原含量與對(duì)照組相比并無(wú)顯著性差異,施加負(fù)荷的第 3天、3周時(shí)也僅較對(duì)照組分別下降了 14.7%和 11.6%,下降幅度并不大,即使肌糖原含量降低較為明顯的第 2周和第 4周,與對(duì)照組相比分別降低 37.8%和

64.1 %,也尚未達(dá)到耗竭的程度。這些結(jié)果說(shuō)明,在骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷過(guò)程中,并未出現(xiàn)由肌糖原耗竭而導(dǎo)致ATP合成原料不足的現(xiàn)象,肌糖原含量的下降并不是導(dǎo)致骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷的直接原因。

許多研究表明,當(dāng)肌肉長(zhǎng)時(shí)間處于收縮狀態(tài)時(shí),由于各種途徑導(dǎo)致的ATP合成障礙、含量降低是引起肌肉損傷的重要原因[8、9]。但也有學(xué)者認(rèn)為肌肉疲勞和損傷與ATP的代謝并不相關(guān)。Saugen[10]等發(fā)現(xiàn):在接近力竭時(shí),肌肉產(chǎn)生肌張力的能力和代謝產(chǎn)物水平都沒(méi)有發(fā)生很大的改變,即使是那些接近力竭的研究對(duì)象,仍可繼續(xù)運(yùn)動(dòng) 15-20分鐘而保持 ATP不下降。洪平等[11]使大鼠進(jìn)行不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭,發(fā)現(xiàn)在 54m/min-66m/min高強(qiáng)度范圍內(nèi) ATP含量較42m/min組顯著性增加,并且較安靜水平略有上升。這些結(jié)果均對(duì)肌肉力竭和損傷時(shí)存在“ATP危機(jī)”的觀點(diǎn)提出質(zhì)疑。

Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶是細(xì)胞內(nèi)各種生物膜上普遍存在的膜結(jié)合酶。它們?cè)谀芰哭D(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)送等方面起著至關(guān)重要的作用。由于這些 ATP酶在發(fā)揮各自的功能時(shí)均有能量依賴性,必須水解 ATP釋放能量,故當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP缺乏時(shí)勢(shì)必導(dǎo)致其活性的下降。因此細(xì)胞內(nèi)ATP酶活性的改變可以反映細(xì)胞內(nèi) ATP含量的變化[12,13]。

在骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷過(guò)程中是否存在由于ATP合成障礙而導(dǎo)致其含量減少的可能呢?為此,本研究通過(guò)測(cè)定肌細(xì)胞線粒體內(nèi)各種 ATP酶活性的變化,來(lái)間接反映ATP含量的改變,籍此對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行討論。

本研究發(fā)現(xiàn),施加 3天至 4周不同時(shí)間靜力性負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌損傷時(shí),大鼠骨骼肌線粒體 Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和 Na+-K+-ATP酶活性與對(duì)照組相比均顯著升高,表明ATP酶均處于較好的功能狀態(tài)。這說(shuō)明在骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷過(guò)程中肌細(xì)胞內(nèi)ATP的含量沒(méi)有降低,并未出現(xiàn)合成原料不足以及合成障礙而導(dǎo)致ATP含量降低的現(xiàn)象。

糖原或葡萄糖在缺氧條件下通過(guò)糖酵解生成乳酸,骨骼肌是乳酸生成的主要場(chǎng)所。大量乳酸解離后將使肌細(xì)胞內(nèi) H+的濃度顯著升高。目前普遍認(rèn)為肌細(xì)胞內(nèi) H+濃度升高是導(dǎo)致肌肉疲勞和損傷的一個(gè)重要因素。Murry等[14]認(rèn)為乳酸、H+等酸性物質(zhì)積聚可引起肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷。Armstrong[15]認(rèn)為運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷與肌肉收縮導(dǎo)致的局部 PH值下降所產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)有關(guān)。

本研究表明,在骨骼肌靜力性負(fù)荷所致?lián)p傷過(guò)程中,骨骼肌細(xì)胞胞漿內(nèi)乳酸及血乳酸含量的變化均表現(xiàn)為施加負(fù)荷 3天時(shí)即產(chǎn)生明顯變化,且 2-4周時(shí)較3天 -1周時(shí)更為明顯。這說(shuō)明,大鼠在進(jìn)行靜力性運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中,由于肌內(nèi)壓持續(xù)較高,局部血管受壓,造成肌肉血供和代謝產(chǎn)物排出障礙,進(jìn)而導(dǎo)致骨骼肌缺血、缺氧,骨骼肌的能量代謝方式以無(wú)氧糖酵解供能為主,乳酸生成增加。值得注意的是,胞漿內(nèi)乳酸及血乳酸的變化與骨骼肌微觀結(jié)構(gòu)損傷的發(fā)生和變化趨勢(shì)一致,由此提示骨骼肌細(xì)胞內(nèi)乳酸等代謝產(chǎn)物堆積產(chǎn)生的毒副作用與骨骼肌靜力性損傷密切相關(guān)。

4 結(jié)論

(1)骨骼肌細(xì)胞能源物質(zhì)耗竭、能量供應(yīng)不足以及糖類氧化不足所引起的三羧酸循環(huán)中介物缺乏并非導(dǎo)致骨骼肌靜力性損傷的直接原因。

(2)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)乳酸等代謝產(chǎn)物堆積產(chǎn)生的毒副作用可能是引起骨骼肌靜力性損傷的重要因素。

[1]David.H.M.Purification and properitiesof an adenosine triphosphatase from sarcoplasmic reticulum[J].Biol Chem.1970,245(17):4508-4518.

[2]Entman,M.L.et al. The sarcoplas mic reticulum-glycogenolytic complex in mammalian fast twitch skeletal muscle. Proposed in vitro counterpart of the contraction-activated glycogenolytic pool[J].Bio. Chem.1980,255:6245-6252.

[3]Friden,J,Seger,J. et al. Topographical localization of muscle glycogen:An ultrahistochemical study in human vastus lateralis[J].Acta Physiological Scandinavica.1989,135:381-391.

[4]Bergstrom,J,L.Hermansen,E.Hultman,and B.Saltin.Diet, muscle glycogen and physicalperformance[J].Acta Physiol Scand.1967,71 :140-150.

[5]Sahlin,K,A.Katz,and S.Broberg. Tricarboxylic acid cycle inter mediates in human muscle during prolonged exercise[J].Am. J. Physiol.1996,259(28):834-841.

[6]Coyle,E.F. Carbohydrate metabolism and fatigue. In:Muscle Fatigue:Biochemical and Physiological Aspects,edited by G.Atlan,L. Beliveau,and P.Bouissou[J].Paris:Masson.1991,153-164.

[7]Coggan,A.R.,and E.F.Coyle.Reversal of fatigue during prolonged exercise by carbohydrate infusion or ingestion[J].Appl.Physiol.1987,63: 2388-2395.

[8]Nagesser,A.S,WJ Vanderlaarse,G Elzinga.Metabolic changes with fatigue in different types of single muscle fibers of Xenopus laevis[J]. Physiol.1992,448:511-523.

[9]田野著.運(yùn)動(dòng)性骨骼肌疲勞機(jī)理研究[M].北京.北京體育大學(xué)出版社.1998.

[10]E.saugen,N.K.,Dissociation between metabolic and contractile responses during intermittent isometric exercise in man[J].Experimental Physiology.1997,82:213-226.

[11]洪平,趙鵬,楊奎生.不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)大鼠骨骼肌能量代謝產(chǎn)物的變化[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2002,21(3):261-267.

[12]朱松君,辛克清等.高壓氧對(duì)外傷性腦水腫家兔線粒體 ATP酶活性的影響[J].中華理療雜志.2000,23(5):159-162.

[13]顏宜臣,張勇.耗竭性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌線粒體內(nèi)膜的影響[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.1996,23(3):281-283.

[14]Murry,C.E,Richand,V.J,Reimer,K,A. et al. Ischemic preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode[J].Circ Res.1990,66(4):913.

[15]Ar mstrong.R.B.Initial events in exercise-induced muscular injury [J].Med.Sci.Sports.Exer.1990,22(4):429-435.

Changes of EnergyM etabolism in the SkeletalM uscle of Rats in Injury Induced by the Dynam ic Load

Chen Xiao-guang,L iu Yue
(School of Physical Education,He’nan Nor malUniversity,Xinxiang 453007)

The animalmodel of injury induced by the dynamic load of skeletalmuscle is used to observe changesof muscle glycogen,ATP activity of muscle mitochondria,cytoplasmic and lactic acid of serum of injury to discuss the relation between change of energy metabolism of skeletal muscle cell and injury induced by dynamic load of skeletal muscle.Results show that TAC resulting from energy material depletion,unbalanced energy supply and carbohydrate oxidative insufficiency is not the direct cause of injury of dynamic load and the important factor accounting for injury of dynamic load is likely to be the side-effect produced bymetabolite accumulated through lactic acid ofmuscle cell.

muscle cell,injury of dynamic load,energymetabolis m

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0065—04

book=65,ebook=82

G804.2

A

1001—9154(2010)09—0065—04

河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (2008B890008)、河南師范大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目 (2008qk26)

陳曉光 (1975-),男,甘肅天水人,碩士,講師。研究方向:運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)。

2010—07—22